枫杨立木中真菌种类及其对杀菌剂的敏感性研究

张钰　魏胜林　谢立群

摘要：通过对拙政园枫杨（Pterocarya stenoptera）中空的树干中真菌的分离，得到可以在枫杨木上寄生的4个菌株，初步鉴定其种类为2个青霉菌（Penicillium spp.）、1个木霉菌（Trichoderma sp.）、1个曲霉菌（Aspergillus sp.）。使用代森锰锌、福美双、甲基托布津、多菌灵和烯唑醇5种不同类型的杀菌剂进行抑菌试验。结果表明，代森锰锌的抑制作用最强，福美双次之；甲基托布津和多菌灵对这4种木腐菌的生长均有一定的影响；烯唑醇的抑制作用随菌类的不同而不同，以对曲霉菌的抑制作用最为明显，而对于其他3个菌株的抑菌效果相对弱些。

关键词：枫杨（Pterocarya stenoptera）； 木腐真菌； 杀菌剂

中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2002-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.022

Abstract： Four fungal strains were isolated from in the hollow trunks of Pterocarya stenoptera in Humble Administrator's Garden. These strains， which confirmed its parasitism in the tree， were identified as Trichoderma sp.， Aspergillus sp. and 2 Penicillium sp.. Mancozeb， thiram， mildothane， carbendazim and diniconazole 5 types of fungicides were used fungistasis test on these fungi. The results showed that the mancozeb had the strongest fungistasis action， and thiram secondly. Mildothane and carbendazim had certain effects on the growth of these four fungi. However， fungistasis effect of diniconazole varies with fungi species， aspergillus was the most obvious， and the other 3 strains were relatively weak.

Key words： Pterocarya stenoptera； wood rotting fungi； fungicides

在苏州园林中，古树名木是世界遗产的重要组成部分，同时也是苏州园林的有机组成部分，保护工作大多集中在这些树木的景观作用、历史人文价值的保护与传承等，或集中在对古树名木的常规保护，古树由于生长年代久远，生长环境异化，树干存在着不同程度被腐蚀的情况。据初步统计，苏州各个园林中，枫杨（Pterocarya stenoptera）、榔榆、银杏、圆柏、黑松等10余个树种存在着树干腐蚀中空，成为开放和半敞开式，或呈上下贯通的圆筒式洞穴，严重削弱树势，降低了枝干的支撑能力和负载能力，甚至直接威胁树体生存[1]，其中以拙政园中的枫杨情况最为严重。拙政园现有古枫杨树7株，树龄100～160 a，存在的主要问题是树干木质部位被侵蚀与腐烂，导致树干中空或树干的残损。

木材腐朽是古树名木保护和古建筑、木桥梁保护中的难题[2]，引起活立木腐朽的主要原因是菌类的寄生，也有其他原因致死后被菌类腐生[3，4]。一般认为，活立木腐朽是由多种真菌、细菌或其他微生物在一定条件下综合引发的。本试验通过对腐朽的枫杨活立木上的真菌进行分离并初步鉴定，以及杀菌剂的抑菌试验，为有效防治枫杨病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

70%代森锰锌可湿性粉剂，四川国光农化股份有限公司生产；酰烯·福美双可湿性粉剂、4.5%酰烯吗啉、30.5%福美双，天津市绿亨化工有限公司生产；70%甲基托布津可湿性粉剂，新沂市科大农药生产；80%多菌灵可湿性粉剂，邢台佰斯特华工科技有限公司生產；12.5%烯唑醇可湿性粉剂，江苏剑牌农药化工有限公司生产。

1.2 真菌的分离和鉴定

在苏州拙政园选已腐朽空洞的枫杨，在无菌条件下取无污染部分，剪下2～5 mm大小的木块，置于PDA平板上，每个平板上放5块，置于26 ℃培养箱中培养3～5 d，并通过平板划线法对所得到的菌进行纯化，得若干个不同的菌株。

将上述菌株分别接种至灭菌的枫杨枝段（直径3 cm，长8 cm）上，观察菌类生长情况，并从枝段上分离真菌。得到与原接种的生长形态、菌落特点完全一致的菌株4个。

对以上4个菌株的培养物在Leica 2000显微镜下观察，根据培养物菌落的性状、孢子、特别是产孢特点进行初步鉴定[5，6]。

1.3 抑菌试验

将70%代森锰锌可湿性粉剂、30.5%福美双可湿性粉剂、70%甲基托布津可湿性粉剂、80%多菌灵可湿性粉剂、12.5%烯唑醇可湿性粉剂5种杀菌剂分别稀释配制成500、1 000、2 000、4 000、8 000倍的药剂溶液。

使用纸碟附着法[7]，将灭过菌的6 mm滤纸圆片浸在70%乙醇中20～30 min，待乙醇挥发后，使用灭菌镊子将滤纸圆片放入待测的孢子悬浮液中，静置5 min，在无菌条件下干燥，然后将带菌的滤纸圆片分别放入稀释500、1 000、2 000、4 000、8 000倍的5种杀菌剂溶液中，浸泡10 min，用灭菌镊子夹取滤纸片，放入培养皿中凝固的培养基上，每个培养基上均匀放置4个滤纸片，加以标记。4种菌，每种杀菌剂1个对照，试验共设25个处理，每个处理重复3次。

将培养基放入温度25 ℃、湿度70%的培养箱中培养3 d，每天观察菌的生长状况，测量菌落的直径，并计算菌丝的生长速度。

菌丝生长速度V（mm/d）=R/D，其中R为菌落的直径；D为培养的天数。

2 结果与分析

2.1 真菌的分离及初步鉴定

根据分离物的培养性状、菌落形态及显微镜观察，1号菌菌落生长迅速，白色，呈圆形扩展，后可扩展至培养皿平板，菌落中央产生孢子层后即变成绿色，菌落周围新生长的菌丝为白色，随着时间的推移，整个菌落可覆盖绿色的孢子层，分生孢子梗垂直对称分枝，分生孢子圆形，初步鉴定为半知菌门丝孢纲木霉属（Trichoderma sp.）；2、4号菌株菌落圆形，分生孢子梗长而直立，顶端具分枝后呈帚状，梗有隔膜，分生孢子为圆形或略呈椭圆形，不同的是2号菌株孢子层绿色，4号菌株孢子层灰绿色，初步鉴定2、4号菌株属于半知菌门丝孢纲青霉属（Penicillium spp.）；3号菌株菌丝体白色，孢子层初期淡褐色，后转褐色，分生孢子圆形，分生孢子梗顶端膨大呈圆球形囊顶，初步鉴定该菌株为半知菌门，丝孢纲曲霉属（Aspergillus sp.）。见图1、图2。

2.2 杀菌剂对菌株生长的影响

2.2.1 对1号菌株生长的影响 杀菌剂对1号菌株生长速度的影响见图3。从图3可以看出，代森锰锌和福美双对于1号菌的生长有显著的抑制作用，随着杀菌剂稀释倍数的增加，对菌丝生长的抑制作用相应减弱。代森锰锌在4 000倍稀释液、福美双在2 000倍稀释液时，基本可以完全抑制1号菌的生长，代森锰锌在8 000倍稀释液时，1号菌平均生长速度为1.033 mm/d，其抑制作用也较为明显，且在同种稀释倍数下，对于1号菌的杀菌抑菌效果比其他几种杀菌剂相对较好。因此，对于1号菌来说，代森锰锌的抑菌效果最好，福美双次之，然后是多菌灵，甲基托布津和烯唑醇的抑制作用最弱。

2.2.2 对2号菌株生长的影响 杀菌剂对2号菌生长速度的影响见图4。由图4可以看出，代森锰锌和福美双对2号菌有明显的抑制作用，且基本与杀菌剂的稀释倍数呈负相关，即杀菌剂的稀释倍数越大，对2号菌的抑制作用越小。代森锰锌在2 000倍稀释液、福美双在500倍稀释液的情况下，2号菌3 d内均未见生长；而福美双在1 000倍稀释液和2 000倍稀释液的情况下，2号菌的生长速度分别为3.017 mm/d和4.200 mm/d，具较强的抑制作用；多菌灵在500倍稀释液时，2号菌的生长速度为6.342 mm/d，在1 000倍稀释液和2 000倍稀释液时，则生长速度分别为6.454 mm/d和9.904 mm/d，抑制作用较福美双弱。因此，对于2号菌来说，以代森锰锌的抑制作用最大，福美双次之，然后是多菌灵，其他两种杀菌剂的抑制作用相对较弱。

2.2.3 对3号菌株生长的影响 杀菌剂对3号菌生长速度的影响见图5。由图5可以看出，代森锰锌、福美双和烯唑醇对3号菌的生长均有较强的抑制作用，代森锰锌在2 000倍稀释液、福美双在500倍稀释液时，未见菌丝生长；福美双在1 000倍稀释液时，菌丝生长速度为0.483 mm/d，抑制作用较强；烯唑醇对3号菌的抑制作用也较为明显，在不大于500倍稀释液时，菌丝体没有生长，在其他浓度时菌丝的生长速度也比较小；甲基托布津和多菌灵对3号菌的抑制作用较弱。

2.2.4 对4号菌株生长的影响 杀菌剂对4号菌生长速度的影响见图6。由图6可以看出，代森锰锌和福美双对4号菌生长有明显的抑制作用，杀菌剂稀释倍数越大，这两种杀菌剂的抑制作用越不明显。代森锰锌在2 000倍稀释液时，未见菌丝生长，在4 000倍稀释液和8 000倍稀释液时，菌丝生长速度分别为1.096 mm/d和1.675 mm/d，表明有较强的抑制作用；福美双在供试浓度范围内，菌丝生长速度均较小，与对照组14.404 mm/d的生长速度差别十分明显；多菌灵、烯唑醇和甲基托布津的抑制作用则较弱。

3 小结与讨论

本研究从枫杨腐朽木中分离得到4个菌株，结合显微形态观察，初步鉴定所得菌株分别属于半知菌门的木霉属、青霉属和曲霉属3个属。

试验表明，试验所用5个不同类型的杀菌剂中，代森锰锌对4种菌的抑制作用最强，特别是在2 000倍稀释液时，4种菌均未见生长，甚至在8 000倍稀释液时，对1号菌和4号菌的抑菌效果仍非常明显；福美双对4种菌有较强的抑制作用，在1 000倍稀释液时，抑制作用较为明显，在2 000倍稀释液以下，1号菌均没有生长，在500倍稀释液以下，对2号菌和3号菌，抑制作用也比较明显，对4号菌有一定的抑制作用；甲基托布津和多菌灵对于4种木腐菌的生长均有一定的影响，但是抑菌效果较代森锰锌和福美双弱，且在各浓度之间的差异不明显；烯唑醇对3号曲霉菌的抑制作用最为明显，在500倍稀释液时，3号菌没有生长，而对其他3个菌株的抑菌效果相对弱些。

不同杀菌剂对4个菌株的影响不同，可能与5种杀菌剂的化学结构与杀菌机理不同有关。代森锰锌、福美双和甲基托布津属于硫代氨基甲酸酯类，多菌灵属于苯并咪唑类，烯唑醇属于三唑类化学药剂；代森锰锌和福美双的作用方式是多位点联合活性，甲基托布津和多菌灵的作用方式是抑制有丝分裂和细胞分裂，烯唑醇的作用方式是抑制膜中固醇的生物合成[8]。笔者认为，可能与试验样本相关，在苏州园林古树名木的防腐、防病虫中，甲基托布津和多菌灵，使用最多，以至于树木上存在的菌类对这类杀菌剂较为适应，而对其他杀菌剂敏感。因此，在实践中，杀菌剂的交替使用显得十分重要。

引起枫杨腐朽的主要原因除了多种真菌[9，10]寄生外，還可能有细菌或其他微生物及原生动物，甚至有昆虫活动的参与，关于细菌的种类和作用也缺乏研究。根据在拙政园的长期定点观察，推测木材在腐朽的不同阶段，优势菌类有所差别，而半知菌类真菌的寄生生长，可能为其他真菌的寄生起着促进作用。相关问题还有待于进一步的研究。

参考文献：

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[5] SCHMIDT O，GAISER O，DUJESIEFKEN D. Molecular identification of decay fungi in the wood of urban trees[J]. Eur J Forest Res，2012，131：885-891.

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