食管癌外周血及肿瘤组织的EGFR突变的检测及意义△

高巍　郭俊俊

陕西省肿瘤医院胸外科，陕西　西安　710061

食管癌外周血及肿瘤组织的EGFR突变的检测及意义△

高巍郭俊俊#

陕西省肿瘤医院胸外科，陕西西安710061

Oncol Prog，2016，14（7）

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在全部恶性肿瘤死亡回顾调查中仅次于胃癌而居第2位，年病死率极高［1］。据估计全世界每年食管癌发病数约20万人，而我国食管癌发病数约占全世界食管癌发病总数60%，是危害我国人民健康的主要恶性肿瘤之一［2］。近年来生物靶向治疗为肿瘤的个体化治疗指明了方向，针对表皮生长因子受体（EGFR）的靶向药物已成功应用于临床食管癌治疗，很大程度上延长了患者的生存时间［3］。实时荧光定量PCR（RT-PCR）通过设计特异性引物和探针，借助荧光信号检测基因有无突变，然后应用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）进行针对性治疗［4］。我国于2010年批准吉非替尼用于晚期食管癌患者EGFR突变治疗［5］。本研究应用RT-PCR技术对食管癌患者外周血和肿瘤组织的EGFR突变状态进行配对检测，分析食管癌患者外周血及肿瘤组织EGFR突变及其与临床特征的关系，探讨两者EGFR突变的一致性，在此基础上，分析EGFR-TKI治疗外周血和肿瘤组织中EGFR突变与临床疾病控制率之间的关系，进一步探讨EGFR突变与吉非替尼或者厄洛替尼临床疗效监测中的应用价值。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2014年1月至2015年9月陕西省肿瘤医院肿瘤科食管癌患者112例的外周血标本，同期收集曾行转移灶活检或手术切除的肿瘤组织标本87例作为研究对象，其中有47例患者同时提供了肿瘤组织和外周血，回顾性整理分析患者临床资料。入选标准：①经CT检查确诊为食管癌患者；②年龄大于18岁；③预计生存时间半年以上；④标本制作前未进行吉非替尼或者厄洛替尼分子靶向药抗肿瘤治疗。排除标准：①患者在确诊后，本研究前进行过相关治疗；②同时接受不同的抗肿瘤治疗；③生育期妇女。肿瘤组织和外周血两组患者的性别、年龄、病理类型比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。（表1）

1.2研究方法

标本采集及DNA提取：112例食管癌患者于早上空腹抽取静脉血4 ml，室温放置2 h后用低温高速离心机将静脉血离心，血清以磁珠法全血基因组DNA抽提试剂盒（美国Omega公司生产）抽提，操作步骤按照试剂盒说明书［6］。收集84例转移灶活检或手术切除的肿瘤组织，取8 μm左右厚度置于1.5 ml的离心管中，使用Qiagen公司FFEPDNA提取试剂盒抽提DNA，操作步骤按照试剂盒说明书［7］。EGFR基因检测：采用荧光定量PCR技术，通过特异性探针水解释放荧光，检测PCR反应的进行，确定EGFR基因突变情况［8］。临床治疗：将获取外周血和肿瘤组织标本后的患者于每日早上口服吉非替尼片（250 mg）1片或厄洛替尼（150 mg）1片，接受TKI治疗的外周血样本的患者45例，其中40例吉非替尼治疗，5例厄洛替尼治疗；接受TKI治疗的肿瘤组织标本的患者40例，全部接受了吉非替尼治疗。直至病情进展或出现不能耐受的不良反应［9］。

1.3结果判定

患者临床疗效按照实体瘤RESCIST疗效评价标准进行评价。完全缓解（CR）：所有靶病灶消失；部分缓解（PR）：靶病灶最长径之和与基线状态比较，至少减少30%；疾病进展（PD）：靶病灶最长径之和与治疗开始后所记录到的最小靶病灶最长径之和比较增加超过20%，或者出现新的病灶；疾病稳定（SD）：于PR和PD之间，不出现新病灶，靶病灶最长径之和与基线状态比较，减少大于30%，增加小于20%。肿瘤客观缓解率=（CR+PR）患者例数/总患者例数×100%，疾病控制率=（CR+PR+SD）患者例数/总患者例数×100%。若患者病情进展或因其他原因终止TKI治疗时，对患者进行总体最佳疗效评价。

以肿瘤组织突变性EGFR患者例数为基础，同时发现外周血突变性EGFR患者例数的概率，即为两者的一致性比率。即：一致性（%）=外周血和肿瘤组织同时突变性EGFR患者例数/肿瘤组织突变性EGFR患者例数。

1.4统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件处理所有临床资料和实验数据。计数资料以百分比（%）表示，比较采用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1食管癌患者外周血EGFR突变及其与临床特征的关系

外周血样本112例中检测到34例EGFR突变，总体突变率达30.36%。其中18外显子1例第2155位碱基G→A突变，占总突变2.94%；19外显子4例2235～2249核苷酸缺失突变，10例2236～2250、2例2254～2277核苷酸缺失突变，占总突变47.06%；21外显子17例L858位亮氨酸转变成精氨酸突变，占总突变50%。19和21外显子突变占总突变的97.06%。EGFR突变在鳞癌组明显高于非鳞癌组（P＜0.05），在年龄、性别上差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.2食管癌患者肿瘤组织EGFR突变及其与临床特征的关系

肿瘤组织样本87例中检测到29例EGFR突变，总体突变率达33.33%。其中无18外显子突变；19外显子8例2235～2249核苷酸缺失突变，6例2236～2250、1例2254～2277核苷酸缺失突变，占总突变51.72%；21外显子14例L858位亮氨酸转变成精氨酸突变，占总突变48.28%。EGFR突变在鳞癌组明显高于非鳞癌组（P＜0.05），在年龄、性别上差异无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表2　患者外周血EGFR突变与临床特征的关系

表3　患者肿瘤组织EGFR突变与临床特征的关系

2.3食管癌患者外周血和肿瘤组织中EGFR突变的一致性

47例患者同时提供了肿瘤组织和外周血。检测到肿瘤组织EGFR突变15例，外周血EGFR突变12例，两者同时EGFR突变的有11例，且这11例外周血和肿瘤组织中的突变位点一致。外周血检测EGFR突变但肿瘤组织中未检测到突变1例，肿瘤组织中检测到EGFR突变但外周血中未检测到突变4例，两者同时野生型EGFR有31例。检测到的EGFR状态以肿瘤组织为标准，两者突变一致性达到73.33%（11/15）。（表4）

表4　47例患者外周血和组织EGFR突变一致性

2.4食管癌患者外周血和肿瘤组织EGFR突变与TKI临床疗效关系

接受TKI治疗的外周血样本的患者45例，其中40例吉非替尼治疗，5例厄洛替尼治疗。32例EGFR突变患者全部接受治疗，17例PR，8例SD，EGFR突变患者TKI治疗客观有效率53.13%（17/32），疾病控制率78.13%（25/32）。接受治疗的EGFR未突变的13例患者中仅有3例SD，且这3例在肿瘤组织中EGFR为突变型。

接受TKI治疗的肿瘤组织标本的患者40例，且全部接受了吉非替尼治疗。27例EGFR突变患者中15例PR，7例SD，EGFR突变患者TKI治疗客观有效率55.56%（15/27），疾病控制率81.48%（22/27），未突变患者2例SD。外周血和肿瘤组织中EGFR突变的患者接受TKI的疾病控制率明显高于EGFR野生型患者（P＜0.01）。外周血与组织同时突变的11例患者，治疗均有效。肿瘤组织中未检测到但外周血中检测到的1例患者病情加重。（表5）

表5　外周血和肿瘤组织EGFR突变与TKI临床疗效的关系

3　讨论

近年来，食管癌在我国的病死率逐年升高，随着医学技术的发展，治疗手段的进步，靶向药物逐渐成为治疗食管癌最有希望的方法之一，其在临床应用中取得了明显疗效［10］。国内外相关报道证实，EGFR突变的食管癌患者使用靶向药物治疗疗效显著，能够有效延长患者的生存时间［11］。EGFR基因突变是肿瘤特异性的体细胞遗传改变，仅在癌细胞出现，体内所有正常细胞均属于野生型［12］。通过检测外周血和肿瘤组织EGFR基因突变状态，为临床应用靶向药物治疗提供依据［13］。外周血采样方便，且能实时监测EGFR突变肿瘤细胞的动态变化，以评价患者对EGFR-TKI的反应［14］。

本研究外周血样本112例中检测到34例EGFR突变，总体突变率达30.36%，EGFR突变在鳞癌组明显高于非鳞癌组（P＜0.05），在年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）；肿瘤组织样本87例中检测到29例EGFR突变，总体突变率达33.33%，EGFR突变在鳞癌组明显高于非鳞癌组（P＜0.05），在年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。但检测的突变率仍是偏低，可能原因：①样本量偏少；②EGFR突变位点较多，本研究只检测了常见的几种突变位点；③可能与检测方法等有关［15］。EGFR突变检测方法很多，主要有测序法、扩增受阻突变系统法（ARMS）、变性高效液相色谱法（DHPLC）以及酶切法等［16］。目前临床上使用最多的，仍是直接测序法［17］。本研究采用RT-PCR法，47例患者同时提供了肿瘤组织和外周血，两者同时EGFR突变的有11例，且这11例外周血和肿瘤组织中的突变位点一致，检测到的EGFR状态以肿瘤组织为标准，两者突变一致性达到73.33%，敏感性高。根据RTPCR特异性引物和探针，通过样本是否具有扩增信号检测基因有无突变。EGFR基因突变位点较多，本研究由于实验条件限制，仅检测了5种突变，是不足之处，应优化实验条件，提高检测的特异性。

本研究接受TKI治疗的肿瘤组织标本的患者40例，EGFR突变患者TKI治疗客观有效率55.56%，疾病控制率81.48%，外周血和肿瘤组织中EGFR突变的患者接受TKI的疾病控制率明显高于EGFR野生型患者，更好地证实了EGFR突变对食管癌的EGFR-TKI分子靶向治疗的疗效预测作用。采用外周血样本进行EGFR突变检测，具有无创性、实时性特点，患者易于接受［18］。RT-PCR检测食管癌外周血中EGFR突变敏感性强，EGFR突变检测可作为临床EGFR-TKI分子靶向治疗的疗效预测［19］。提高靶向治疗的精确性，为患者带来积极的治疗效果，为医生临床合理用药提供依据，从而节约医疗和社会资源［20］。

［1］Rivera MP.Multimodality therapy in the treatment of lung cancer［J］.Semin Respir Crit Care Med，2012，25（2）:395-401.

［2］Scagliotti GV，Selvaggi G，Novello S，et al.The biology of epidermal growth factor rceptor in lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2011，10（12）:4227-4232.

［3］Franklin WA，Veve R，Hirsch FR，et al.Epidermal growth factor receptor family in lung cancer and premalignancy［J］. Semin Oncol，2012，29（1）:3-14.

［4］Yarden Y.The EGFR family and its ligands in human cancer:signaling mechanisms and therapeutic opportunities［J］. Eur J Cancer，2011，37（Suppl 4）:3-8.

［5］Bergstrom JD，westermark B，Heldin NE.Epidermal growth factor receptor signaling activates met in human anaplastic thyroid carcinoma cells［J］.Exp Cell Res，2010，259（1）:293-299.

［6］Denning MF，Dlugosz AA，Cheng C，et al.Cross-talk between epidermal growth factor receptor and protein kinase C during calcium-induced differentiation of keratinocytes［J］.Exp Dermatol，2010，9（3）:192-199.

［7］Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy［J］.Science，2013，304（5676）:1497-1500.

［8］Mitsudomi T，Yatabe Y.Mutations of the epidermal growth factor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer［J］.Cancer Sci，2014，98（12）:1817-1824.

［9］Mok TS，Wu YL，Thongprasert S，et al.Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma［J］.N Engl J Med，2009，361（10）:947-957.

［10］Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，et al.Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers［J］.J Natl Cancer Inst，2011，97（5）:339-346.

［11］Riely GJ，Pao W，Pham D，et al.Clinical course of patients with non-small cell lung cancer and epidermal growth factor receptor exon 19 and exon 21 mutations treated with gefitinib or erlotinib［J］.Clin Cancer Res，2006，12（3）: 839-844.

［12］Sonobe M，Tanaka F，Wada H.Lung cancer-related genes in the blood［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2014，10（4）: 213-217.

［13］Therasse P，Arbuck SG，Eisenhauer EA，et al.New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors［J］.JNCI，2010，92（3）:205-216.

［14］孙燕，石远凯.临床肿瘤内科手册［M］.北京:人民卫生出版社，2007:149-156.

［15］Cappuzzo F，Hirsch FR，Rossi E，et al.Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2010，97（9）:643-655.

［16］Kimura H，Kasahara K，Kawaishi M，et al.Evaluation of epidermal growth factor receptor mutations status in serum DNA as a predictor of the response to gefitinib［J］. Brit J Cancer，2014，97（9）:778-784.

［17］黄进肃，董强刚，许凯黎，等.血清循环DNA的EGFR基因突变与肺癌选择性靶向治疗研究［J］.肿瘤，2007，27（12）:968-972.

［18］Rosell R，Moran T，Queralt C，et al.Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer［J］.N Engl J Med，2009，36（10）:958-967.

［19］杨锦.非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤组织表皮生长因子受体突变的研究［D］.太原:山西医科大学，2011:3.

［20］乔媛媛.食管癌外周血循环肿瘤细胞检测方法和生物学特征的研究［D］.广州:南方医科大学，2012:5.

Detection of EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissues of esophageal cancer and the significance△

GAO Wei GUO Jun-jun#
Department of Thoracic Surgery，Shaanxi Cancer Hospital，Xi'an 710061，Shaanxi，China

目的分析食管癌患者外周血及肿瘤组织EGFR突变与临床特征关系，探讨外周血及肿瘤组织中EGFR突变的一致性，进一步分析EGFR-TKI治疗外周血和肿瘤组织中EGFR突变与临床疾病控制率之间的关系，进一步探讨EGFR突变与吉非替尼或者厄洛替尼临床疗效监测中的应用价值。方法采用RT-PCR检测112例食管癌患者外周血和87例食管癌患者肿瘤组织中EGFR突变，其中47例外周血和肿瘤组织配对检测。分析外周血和肿瘤患者组织中EGFR突变与临床特征的关系及两者EGFR突变的一致性。采用EGFR-TKI治疗外周血和肿瘤组织中EGFR突变，评价EGFR突变与吉非替尼或者厄洛替尼临床疗效的关系。结果EGFR突变在鳞癌组明显高于非鳞癌组（P＜0.05）；肿瘤组织和外周血同时EGFR突变的有11例，且突变位点一致，检测到的EGFR状态以肿瘤组织为标准，两者突变一致性达到73.33%；外周血和肿瘤组织中EGFR突变的患者接受TKI的疾病控制率明显高于EGFR野生型患者（P＜0.01）。结论食管癌外周血和肿瘤组织EGFR突变与临床特征的关系与鳞癌密切相关；食管癌外周血和肿瘤组织EGFR突变的一致性较高；EGFR-TKI分子靶向治疗外周血和肿瘤组织中EGFR突变的疗效显著。

食管癌；外周血；肿瘤组织；EGFR突变

ObjectiveTo study the correlation between EGFR mutation in peripheral blood or tumor tissues in esophageal cancer and the clinical features，and then discuss the consistency of both EGFR mutations，to investigate the relationship between EGFR-TKI treatment for EGFR mutations and the clinical disease control rate（DCR），as well as the use of gefitinib or erlotinib in clinical efficacy monitoring.MethodThe EGFR mutations in peripheral blood of 112 cases and in tumor tissues of 87 cases of esophageal cancer were detect using RT-PCR，in which 47 cases had matched tests of peripheral blood and tumor tissue.The relationship between EGFR mutations in peripheral blood or tumor tissues and clinical features and the consistency of the EGFR mutations were investigated；EGFR-TKI treatment was administered，and the correlation between EGFR mutations and clinical efficacy of gefitinib or erlotinib were analyzed.ResultEGFR mutations in squamous cell carcinoma group were significantly higher than that of non-squamous cell carcinoma group（P＜0.05）；11 cases had EGFR mutations in both peripheral blood and tumor tissue，with same mutation sites；Taking EGFR status detected in tumor tissue as the standard，a high consistency was observed at 73.33%；The DCR in patients with EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissues of patients receiving TKIs were significantly higher than those with wild-type EGFR（P＜0.01）.ConclusionThe correlation between EGFR mutations in peripheral blood or tumor tissues and clinical features of esophageal cancer patients is closely related with squamous carcinoma；The EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissues of esophageal cancer are highly consistent；EGFR-TKIs molecule targeted therapy is significantly effective in treating the EGFR mutations in peripheral blood and tumor tissue.

esophageal cancer；peripheral blood；tumor tissue；EGFR mutation

R735.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.09

2016-01-18）

陕西省卫生厅扶植项目（D类项目）（2012D45）

（corresponding author），邮箱：1446701185@qq.com