结核分枝杆菌重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3诊断结核病*

谢 琳，任琪琪，郭婧玮，谭云洪，蒋华科，袁仕善

（1.湖南师范大学第一附属医院 / 湖南省人民医院检验科，长沙 410002；2.湖南师范大学医学院，长沙 410013；3湖南省胸科医院，长沙 410013）

结核分枝杆菌重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3诊断结核病*

谢 琳1，任琪琪2，郭婧玮3，谭云洪3，蒋华科2，袁仕善2

（1.湖南师范大学第一附属医院 / 湖南省人民医院检验科，长沙 410002；2.湖南师范大学医学院，长沙 410013；3湖南省胸科医院，长沙 410013）

目的：重组表达结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-Hsp16.3，分析其诊断结核病的价值。方法：重组PCR扩增TB10.4-Hsp16.3融合基因，克隆至pMD18-T载体，测序鉴定后，亚克隆至原核表达载体pET28a（+），PCR和双酶切鉴定阳性重组子，将重组DNA转化E.coli BL21，筛选阳性菌株，经IPTG诱导表达融合蛋白TB10.4-Hsp16.3，超声裂解菌体，对包涵体进行变性溶解和复性，金属螯合层析纯化，Western blot分析其免疫学活性，ELISA评价其诊断结核病的价值。结果：成功获得约750bp的融合基因TB10.4-Hsp16.3，构建了融合蛋白的重组表达质粒pETTB10.4-Hsp16.3，表达、纯化获得分子量约29kDa的融合蛋白，能被结核病患者血清特异识别；其ELISA诊断结核病的灵敏度为89.3%，特异度为90.7%，阳性预测值为90.9%，阴性预测值为89.1%，诊断效率达90.0%。结论：成功表达可用于结核病诊断的结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-Hsp16.3。

结核分枝杆菌；TB10.4-Hsp16.3；表达；结核病

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病。早期诊断和治疗是TB防治的重要手段［1］。血清学诊断的关键在抗原，单一抗原的抗原谱较窄，含多个结核特异性抗原决定簇的融合蛋白是一种有效的寻找TB诊断特异性抗原的方法［2］。本文旨在构建Mtb融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的原核表达体系，为其用于TB诊断和疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂及菌种 PCR扩增试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、pMD18-T vector、限制性内切酶BamH I 和Hind III均购自大连宝生物工程公司；E.coli DH5ɑ，E.coli JM109，E.coli BL21，pET-28a（+）为本室保存；Mtb标准菌株H37Rv由湖南省胸科医院检验科提供。

1.1.3 血清 TB阳性血清由湖南省胸科医院检验科提供；非结核肺病患者及健康体检者血清由湖南省人民医院检验科提供。

1.2 方法

1.2.1 融合基因TB10.4-Hsp16.3的扩增 根据Genbank报道的Mtb H37Rv株TB10.4和Hsp16.3基因序列设计如下引物：TB10.4上游引物（P1）：GGAT CCATGTCGCAAATCATGTACAACT，TB10.4下游重叠引物（P2）：GCTTCCACCGCCACCGCCGCCCCATTTG；Hsp16.3上游重叠引物（P3）：GGTGGCGGTGGAAGCATG GCCACCACC，Hsp16.3下游引物（P4）：AAGCTTTCAGTT GGTGGACCGGATC。P1含BamH I 酶切位点，P4含Hind III酶切位点。委托上海铂尚生物技术公司合成。按文献［3］提取Mtb H37Rv基因组DNA为模板，分别以P1和P2、P3和P4为引物对，扩增TB10.4和Hsp16.3基因片段。回收纯化TB10.4和Hsp16.3，重叠延伸PCR扩增融合基因TB10.4-Hsp16.3，回收纯化融合基因TB10.4-Hsp16.3。

1.2.2 TB10.4-Hsp16.3的克隆与鉴定 将TB10.4-Hsp16.3连接到克隆载体pMD18-T载体，转化E.coli JM109感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆，进行测序鉴定。

1.2.3 重组TB10.4-Hsp16.3表达载体的构建 将含pMD18-T-TB10.4-Hsp16.3与pET28a（+）的E.coli JM109分别接种于相应抗性的LB培基中放大培养，碱裂解法提取质粒DNA。BamH I、Hind III双酶切并回收纯化目的基因及表达载体片段，将载体和目的基因混合，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5ɑ感受态细胞，筛选阳性重组子，PCR及质粒DNA双酶切鉴定。

1.2.4 TB10.4-Hsp16.3的表达与纯化 将重组子质粒DNA转化E.coli BL21，筛选阳性菌株，接种于含50mg/L卡那霉素的LB培基中培养过夜，按1：100放大培养至OD600约0.6，加IPTG至0.01mmol/L，37℃诱导2h，离心收集菌体，裂解液重悬，反复冻融3次，冰浴超声（250W，5s，40次），4℃ 11 000 r/min离心30min，收集上清和沉淀。将沉淀溶解于含8mol/L尿素的裂解液，4℃静置平衡约1h，4℃ 11 000 r/min 离心20min，收集上清，缓慢加入裂解液梯度倍比稀释至尿素浓度为4mol/L、2mol/L，使蛋白缓慢复性，4℃静置过夜。11 000 r/min离心30min，取上清，His-bindTM柱亲和层析纯化TB10.4-Hsp16.3，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白的表达。用 pH7.4的磷酸盐缓冲液透析去除咪唑，中间换液6次。

1.2.5 TB10.4-Hsp16.3的免疫活性分析 纯化的重组蛋白经12%SDS-PAGE分离后，转移至NC膜，5%脱脂奶粉封闭，将膜分别与1：100稀释的TB患者阳性混合血清和健康体检者混合血清于37℃作用2h，洗膜，加1：3000稀释的HRP-羊抗人IgG，37℃ 作用2h，洗膜，以增强型ECL化学发光检测观察结果。

1.2.6 TB10.4-Hsp16.3的ELISA检测结核病人血清抗体 将TB10.4-Hsp16.3稀释至0.25μg/100µL，100µL/孔包被微孔板，4℃孵育过夜；弃包被液，加封闭液于37℃作用2h；洗板；加1：100稀释的待测血清，37℃ 作用2h；洗板；加1：3000稀释的HRP-羊抗人IgG，37 ℃作用2h；洗板；加TMB显色液A、B各1滴，显色5-10min，加终止液1滴，于酶标仪上读取 OD450。以健康体检者血清OD450均值+2SD为界限值，评价待测血清的检测结果。

2 结果

2.1 融合基因TB10.4-Hsp16.3的扩增 重组PCR技术扩增融合基因的电泳图谱如图1和图2。由图1可知，PCR技术分别获得了约300bp的 TB10.4基因和约450bp 的Hsp16.3基因，重叠PCR获得约750bp的融合基因TB10.4-Hsp16.3。

图1 TB10.4、Hsp16.3基因的扩增

图2 TB10.4-Hsp16.3基因的扩增

2.2 TB10.4-Hsp16.3的克隆与鉴定 阳性克隆菌落PCR见图3。由图3可知，阳性克隆菌落PCR获得约750bp的片段。测序分析发现，克隆序列与GenBank报道的TB10.4及Hsp16.3序列相比，在Hsp16.3的第115位由A突变为G，相应氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸，第424位由G突变为A，相应氨基酸由丝氨酸变为苯丙氨酸。

图3 pMD18-T-TB10.4-Hsp16.3的菌落PCR

2.3 重组TB10.4-Hsp16.3表达质粒的构建 重组TB10.4-Hsp16.3表达质粒的PCR和双酶切图谱见图4，pET-TB10.4-Hsp16.3质粒PCR和双酶切均获得750bp的目的片段。

图4 pET-TB10.4-Hsp16.3的菌落PCR及双酶切鉴定

2.4 TB10.4-Hsp16.3的表达与纯化 重组TB10.4-Hsp16.3的电泳图谱见图5。由图5可知，表达的融合蛋白主要存在于包涵体中。经尿素变性溶解、复性后，金属螯合层析获得约29kDa的目的蛋白。

图5 TB10.4-Hsp16.3的表达与纯化

2.5 TB10.4-Hsp16.3的免疫活性分析 TB10.4-Hsp16.3的免疫印迹图谱见图6，纯化的TB10.4-Hsp16.3可被TB患者混合血清识别，在约29kDa处有特异的显色条带，而与正常体检者混合血清无反应，表明其具有良好的免疫活性。

图6 TB10.4-Hsp16.3的免疫活性鉴定

2.6 TB10.4-Hsp16.3的ELISA检测结核病人血清抗体 以健康体检者血清OD450均值+2SD为正常界限值，56例TB患者中阳性为50例，53例非结核肺病患者中阳性为5例，54例健康体检者中阳性为5例，其检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断效率依次为89.3%、90.7%、90.9%、89.1%、90.0%。

3 讨论

TB在全球范围内又呈现出蔓延的趋势［4］，这给TB的诊断提出了更高的要求。血清学诊断简便、快速、价格低廉，已在多个TB高负担国家得到广泛应用［5］，但该法关键是获得敏感性和特异性均高的诊断抗原。TB10.4作为Mtb主要的T细胞抗原，是Mtb早期分泌蛋白ESAT-6家族新发现的成员，能被约70%以上TB病人T细胞强烈识别，释放高水平的γ-IFN，更好地促进Th1细胞增殖分化，活化巨噬细胞、CTL细胞等，清除感染Mtb的靶细胞，具有比其他家族成员更强的免疫原性，能在Mtb感染过程中刺激机体产生抗体，是Mtb表现其毒力必不可少的因子，其作为一种替代ESAT-6的结核候选抗原不断受到关注［6，7］。Mtb小分子热休克蛋白Hsp16.3是Mtb在进入宿主巨噬细胞等情况下大量诱导合成的一种蛋白，是Mtb重要免疫保护性抗原，对Mtb在宿主巨噬细胞内长期生长、繁殖和致病有重要作用［8］。Hsp16.3作为一种TB血清学抗原已被广泛研究。以Hsp16.3蛋白为抗原的ELISA检测临床标本Mtb抗体的灵敏度67.0%，特异度100%，准确度84.0%，具有潜在的诊断价值（苏明权等，2006）。

现有的单一抗原均不能被全部或大多数TB患者血清识别，将多个抗原或多肽融合表达，可获得更有效和广泛的抗原表位，提高免疫反应效率和检测灵敏度［9，10］，以期满足TB临床诊断的需要。融合蛋白Ag85B-Hspl6.3具有Ag85B和Hsp16.3的抗原表位，既可检出Mtb活动期病人，也可检出Mtb休眠期病人，可进一步提高Mtb感染检测的灵敏度和特异性［11］。融合蛋白作为一种抗原来诊断Mtb感染，其敏感性高于单一的蛋白，同时保持了较高的特异性［12，13］，具有良好的应用前景和研究价值。

本文采用重叠延伸PCR扩增获得融合基因TB10.4-Hsp16.3，其阳性克隆测序结果显示，第115位由A突变为G，相应氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸，第424位由G突变为A，相应氨基酸由丝氨酸变为苯丙氨酸，其他氨基酸序列未发生改变；且经ProtScale蛋白质亲疏水性分析、SOPM二级结构分析、TMHMM Server v.2.0跨膜螺旋分析，以及免疫印迹及ELISA证实不影响融合蛋白的免疫活性。表达的重组融合蛋白主要为包涵体形式存在。将包涵体用尿素溶解变性、复性，用金属螯合层析纯化，获得纯化的TB10.4-Hsp16.3。重组融合蛋白TB10.4-Hsp16.3具有较好的检测灵敏度和诊断效率。下一步研究将建立重组TB10.4-Hsp16.3的纳米金生物传感器，为开发新型的Mtb诊断试剂提供新的实验依据。

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Diagnosis of Tuberculosis with recombinant fusion protein TB10.4-Hsp16.3 from Mycobacteria tuberculosis

Xie Lin1， Ren Qi-qi2，Guo Jing-wei3， Tan Yun-hong3， Jiang Hua-ke2， Yuan Shi-shan2，
（1.Clinical Laboratory， The First Affiliated Hospital of Hunan Normal University， Changsha， 410002， China；2.Hunan Normal University School of Medicine， Changsha 410013， China；3. Hunan Chest Hospital， Changsha， 410013， China）

Objective To clone and express the recombinant fusion protein TB10.4-Hsp16.3 of Mycobacteria tuberculosis（M. tuberculosis） and analyze the value of diagnosis of tubercul-osis. Methods The fusion gene TB10.4-Hsp16.3 was amplified by recombinant PCR from ge-nomic DNA of M. tuberculosis and was cloned into pMD18-T vector. Positive clones was identified by clony PCR and DNA sequencing. The fusion gene TB10.4-Hsp16.3 was subcl-oned into the prokaryotic expression vector pET28a（+） and identified by colony PCR and do-uble enzyme digestion，TB10.4-Hsp16.3 was expressed in E.coli BL21 containing recombinant plasmid pET-TB10.4-Hsp16.3 when induced by IPTG； Bacterial precipitation was dis-sociated by ultrasonic lysis method， the inclusion body was dissolved in 8mol/L urea and the fusion protein TB10.4-Hsp16.3 was renatured by low urea gradient and then purified by nickel ch-elate affinity chromatography.The immunological activity of TB10.4-Hsp16.3 was analyzed by western-bolt and the diagnosis efficiency for tuberculosis was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay.Results The Amplified fusion gene TB 10.4-Hsp16.3 was about 750bp； the recombinant expression plasmid pET-TB10.4-Hsp16.3 was constructed through subcloning the fusion gene TB10.4-Hsp16.3 into prokaryotic expression vector pET28a（+）；The fusion pro-tein was expressed in E.coli BL21 containing plasmid pET-TB10.4-Hsp16.3 when induced by IPTG and was purified from the lysate； the fusion protein was about 29 kDa and recognizedby antibodies of tuberculosis sera. The sensitivity，specificity，positive predictive value， negativepredictive value and the diagnostic efficiency of ELISA using fusion protein TB10.4-Hsp16.3 as antigen to detect tuberculosis was showed to be 89.3%， 90.7%， 90.9%， 89.1%， 90% re-spectively. Conclusion The recombinant fusion protein TB10.4-Hsp16.3 which can be used to test tuberculosis was successfully expressed and purified from prokaryotic expression E.coli lysate.

Mycobacteria tuberculosis； TB10.4-Hsp16.3； expression； Tuberculosis

R52

A

1673-016X（2016）02-0012-04

2015-12-03

湖南省研究生创新性项目（CX2015B184）

袁仕善，E-mail：yuanshishan@aliyun.com