罗丹明B酶联免疫分析方法的建立与应用

王　琳，王　雪，田静秒

（北京普析通用仪器有限责任公司，北京 101200）

罗丹明B酶联免疫分析方法的建立与应用

王琳，王雪，田静秒

（北京普析通用仪器有限责任公司，北京 101200）

建立一种用于检测罗丹明B的间接竞争酶联免疫分析方法。该方法的IC50为1.3ng/mL，检测限为0.786ng/g。该方法检测豆瓣酱，加标浓度5ng/g，平均回收率为83%，加标浓度10ng/g，平均回收率为89%；检测辣椒酱，加标浓度5ng/g，均回收率为88%，加标浓度10ng/g，平均回收率为104%；检测辣椒油，加标浓度5ng/g，平均回收率为94%，加标浓度10ng/g，平均回收率为101%；检测辣椒粉，添加浓度5ng/g，平均回收率为82%，加标浓度10ng/g，平均回收率为90%。该方法的平均批内差为9.0%，批间差为10.5%，与其他常见染料未见交叉反应。该方法操作简便，结果准确，适用于罗丹明B的现场大量样品快速检测。

酶联免疫分析法；罗丹明B；豆瓣酱；辣椒酱；辣椒油；辣椒粉

0　引　言

罗丹明B（Rhodamine B，RhB）是一种鲜桃红色人工合成染料，为致癌物质［1］。2008年卫生部发布《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》，明确规定禁止在食品中添加罗丹明B类工业染料。因此，建立一种快速灵敏的检测食品中非法添加的罗丹明B的方法非常必要。

目前，罗丹明B的检测主要是仪器分析，如高效液相-荧光检测法［2-3］和高效液相-质谱联用检测法［4］，而免疫分析相关产品在市场上较少。但实验室分析用仪器设备及其运行维护成本较高，对操作人员的专业要求也较高。酶联免疫分析较仪器分析更具优势。

目前，已有苏丹红［5］、孔雀石绿［6］等染料的酶联免疫分析方法，而采用酶联免疫方法检测罗丹明B的相关报道很少。宋姗姗等［7］建立了一种罗丹明B的酶联免疫检测方法，检测辣椒粉中的罗丹明B，回收率为68.1%到89.3%。Michalina Oplatowska等［8］建立了罗丹明B与甲基黄的酶联免疫检测方法，检测调味酱与香料中的罗丹明B与甲基黄，可以检测出10 ng/g的罗丹明B与15 ng/g的甲基黄。本研究针对成分复杂、状态粘稠的实际样品，对样品前处理方法进行研究与改进，建立了一种更加灵敏、便捷地检测罗丹明B含量的酶联免疫方法，验证了该方法在检测豆瓣酱等调味品中的罗丹明B含量方面的应用。

1　试剂与材料

1.1试剂

罗丹明B单克隆抗体，与罗丹明B合成抗原购于广州优抗多生物技术有限公司；酶标羊抗鼠二抗购于Jackson公司；显色液A、显色液B与终止液购于北京普析通用仪器有限责任公司；牛血清白蛋白购于北京阿匹斯生物技术有限公司；其他化学试剂购于西陇化工股份有限公司。

1.2材料与设备

96孔可拆卸酶标板购于中生华美（北京）科技有限公司。酶标仪，Thermo Scientific。

2　方　法

1）包被：罗丹明B合成抗原包被96孔板，包被量为每孔100μL，4℃过夜；用洗涤液洗涤3次，每次300μL/孔，拍干。2）封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃温育3h；用洗涤液洗涤3次，每次300 μL/孔，拍干。3）加样：每孔依次加入样品，酶标二抗，与罗丹明B单克隆抗体，各50μL；4）孵育：室温孵育30min后，用洗涤液洗涤5次。5）显色：每孔加入显色液A与显色液B各50μL，室温避光作用15min。6）每孔加入50 μL终止液，用酶标仪检测其450 nm处的OD值。

2.2ELISA方法的建立与优化

1）用碳酸盐缓冲液（CB）将RhB合成抗原分别稀释5000，10000，20000倍，用于包被，按照表1进行操作，以确定抗原的最佳包被浓度。2）用磷酸盐缓冲液（PBS）将RhB单克隆抗体分别稀释5 000，10 000和20000倍，用于反应，按照表1进行操作，以确定抗体的最佳反应浓度。3）用PBS将酶标二抗分别稀释1 000和2 000倍，用于反应，按照表1进行操作，以确定酶标二抗的最佳反应浓度。将IC50作为评价ELISA参数优化的标准，IC50越低说明灵敏度越高［9］，IC50为使抑制率达到50%时的RhB浓度。

2.3方法灵敏度

该方法的灵敏度由检测限表示，根据酶联免疫吸附法试剂（盒）的检验标准［10］，检测限的检测方法为：用样品稀释液重复检测20次，计算吸光度平均值（M）和标准差（SD），以及M-2SD所对应的吸光度值；将M-2SD所对应的吸光度值带入标准曲线方程，计算得到的结果即为方法检测限。

通路分析是通过对选定的基因按照公共数据库KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）进行分类，通过离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著相关的通路分类，本研究利用通路在线分析平台Omicshare（http://www.omicshare. com）以P＜0.5、FDR＜0.05为参数获得钩藤散治疗AD相关基因的通路富集信息，并使用Cytoscape-v3.6.1构建靶点-通路（T-P）网络图。

2.4样品前处理方法优化

豆瓣酱样品采用3种方法进行前处理：1）豆瓣酱样品均质后，加入乙腈提取，振荡，离心后取上清液，氮气吹干，再加入样品稀释液复溶，取50μL复溶后的溶液检测。2）豆瓣酱样品均质后，加入乙腈与正己烷提取，振荡，离心后取乙腈相，氮气吹干，再加入样品稀释液复溶，取50μL复溶后的溶液检测。3）豆瓣酱样品均质后，依次加入水、乙腈与正己烷提取，振荡，离心后取乙腈相，氮气吹干，再加入样品稀释液复溶，取50μL复溶后的溶液检测。

取1g豆瓣酱，分别添加5ng与10ng罗丹明B，按照上述3种方法进行前处理，计算加标回收率，回收率越接近100%，检测结果越准确。

2.5方法加标回收率

取1g豆瓣酱或辣椒酱，分别添加5，10 ng罗丹明B，均质，加入1mL水，剧烈振荡混匀；再加入4mL乙腈，剧烈振荡30 s；再加入5 mL正己烷，剧烈振荡5 min；离心后取1 mL乙腈相；氮气吹干；再加入1mL样品稀释液复溶；取50μL复溶后的溶液检测。每个样品重复检测6次，计算加标回收率与回收率的变异系数。

取1g辣椒油，分别添加5，10ng罗丹明B，均质；加入4mL乙腈，剧烈振荡30s；再加入5mL正己烷，剧烈振荡5 min；离心后取1 mL乙腈相；氮气吹干；再加入1mL样品稀释液复溶；取50μL复溶后的溶液检测。每个样品重复检测6次，计算加标回收率与回收率的变异系数。

取1g辣椒粉，分别添加5，10ng罗丹明B，均质；加入5mL乙腈，剧烈振荡30s；再加入5mL正己烷，剧烈振荡5 min；离心后取1 mL乙腈相；氮气吹干；再加入1mL样品稀释液复溶；取50μL复溶后的溶液检测。每个样品重复检测6次，计算加标回收率与回收率的变异系数。

2.6方法批内差与批间差

制备3批罗丹明B的酶联免疫分析试剂，用于检测豆瓣酱中的罗丹明B，样品分别使用3批试剂检测，每批试剂检测10次，计算批内差与批间差。

2.7方法特异性

选择5种常用染料：苏丹红，酸性橙II，碱性橙2，碱性橙21，碱性橙22，配制成不同质量浓度（1000，2000，5000，10000ng/mL）的溶液，检测其与罗丹明B的交叉反应率。

3　结果与分析

3.1ELISA方法的建立与优化

检测不同包被条件与反应条件下的标准曲线，得到标准曲线的IC50如表1所示。可以确定，抗原的最佳包被浓度为稀释10000倍（终浓度为1μg/mL），单克隆抗体的最佳反应浓度为稀释20 000倍（终浓度为0.5 μg/mL），酶标二抗的最佳反应浓度为稀释1 000倍（终浓度为1μg/mL）。

表1　不同条件下的IC50值

根据最佳条件检测得到的标准曲线如图1所示，线性范围为0.3～8.1ng/mL，IC50为1.3ng/mL。

图1　标准曲线

3.2方法灵敏度

检测样品稀释液的吸光度值，计算吸光度值的M-2SD所对应的吸光度值为1.996，根据标准曲线，计算得到对应的浓度为0.786ng/g，因此该方法的检测限为0.786ng/g。进出口食品中罗丹明B的检测行业标准规定，液相色谱-荧光法及液相色谱-质谱/质谱法的检测限均为0.005mg/kg［11］，可见该方法的检测限可以满足检测罗丹明B的要求。

3.3前处理方法优化

豆瓣酱按照2.4的3种方法进行前处理，加标回收率如表2所示。由表可知，依次加入水、乙腈、正己烷提取是最优的前处理方法，检测结果最准确。罗丹明B易溶于甲醇、乙腈等极性较强的溶剂、在正己烷、氯仿等极性较弱的溶剂中溶解度较小，因此采用乙腈提取。豆瓣酱中含有脂类杂质，可能会干扰检测，因此在样品前处理时加入正己烷，除去脂类杂质，会使检测结果更准确。豆瓣酱样品比较粘稠，在乙腈中不易分散，因此在样品前处理时加入水，增加分散性，会使检测结果更准确。

表2　不同前处理方法的加标回收率

3.4方法加标回收率

不同样品的加标回收率与回收率的变异系数见表3。豆瓣酱的加标回收率在73%～106%之间，变异系数在9.2%～9.9%之间。辣椒酱的加标回收率在76%～110%之间，回收率的变异系数在4.8%～14.1%之间。辣椒油的加标回收率在74%～106%之间，回收率的变异系数在6.9%～8.2%之间。辣椒粉的添加回收率在73%～106%之间，回收率的变异系数在9.1%～11.3%之间。说明该方法检测豆瓣酱等调味料的准确性与重复性较好。

表3　样品加标回收率与变异系数

3.5方法批内差与批间差

样品分别使用3批试剂检测，每批试剂检测10次，批内差与批间差见表4。由表可知，批内差在8.4%～9.4%之间，小于10%，批间差10.5%，小于15%，说明该方法的批内差异与批间差异较小。

表4　批内差与批间差

3.6方法特异性

罗丹明B与苏丹红，酸性橙II，碱性橙2，碱性橙21，碱性橙22的交叉反应见表5。由表可见，上述染料与罗丹明B均没有交叉反应，说明该方法检测罗丹明B的特异性良好。

表5　罗丹明B与常见染料的交叉反应

4　结束语

本研究通过优化罗丹明B酶联免疫分析试剂的反应参数，包括抗原包被条件，抗体与酶标二抗的工作浓度，建立了罗丹明B的酶联免疫分析方法，检测限为0.786ng/g，灵敏度较高。本研究通过优化样品前处理方法，建立了以水、乙腈、正己烷3种提取液为基础的样品前处理方法，检测豆瓣酱等调味品中的罗丹明B，平均回收率在82%～104%之间，平均批内差为9.0%，平均批间差为10.5%，准确度较高。该方法操作简便，结果准确，适用于罗丹明B的现场大量样品快速检测。

在上述研究成果的基础上，可将研究化学发光免疫分析技术应用于罗丹明B的检测［12］，在基底上包被罗丹明B合成抗原，依次加入样品，酶标二抗，罗丹明B单克隆抗体，形成抗原-抗体-酶免疫复合物，洗涤后加入发光底物，酶催化底物发光，通过检测发光强度计算样品中罗丹明B的浓度，与现有的酶联免疫分析方法相比，该方法可以提高灵敏度，扩展线性范围。

也可应用磁微粒偶联免疫分析技术［13］，在磁微粒表面连接罗丹明B合成抗原，将磁微粒偶联物，样品，罗丹明B单克隆抗体，酶标二抗混合，形成磁微粒-抗原-抗体-酶免疫复合物，磁分离后加入底物，酶催化底物显色或发光，通过检测信号计算样品中罗丹明B的浓度，与现有的酶联免疫分析方法相比，该方法可以减少操作步骤，缩短检测时间。

［1］LARSEN J C.Legal and illegal colours［J］.Trends in Food Science&Technology，2008（19）：64-69.

［2］施琦贻，陈成.高效液相色谱法测定辣椒中的胭脂红、酸性橙II、碱性橙II、罗丹明B［J］.农业机械，2011（32）：133-136.

［3］王传现，韩丽，方晓明，等.食品中罗丹明B的高效液相色谱荧光检测［J］.分析仪器，2008（1）：27-33.

［4］程慧，李兵，占春瑞.腊肠中罗丹明B的高效液相色谱串联质谱检测方法［J］.食品科学，2010，31（4）：223-225.

［5］ANFOSSIL，BAGGIANIC，GIOVANNOLI C，et al. Development of enzyme-linked immunosorbent assays for Sudan dyes in chilli powder，ketchup and egg yolk［J］. Food Addit Contam，2009（26）：800-807.

［6］XING W，HE L，YANG H，et al.Development of a sensitiveandgroup-specificpolyclonalantibodybased enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）for detection of malachite green and leucomalachite green in water and fish samples［J］.Food Agric，2009（89）：2165-2173.

［7］SONGSS，LINF，LIU L Q，et al.Immunoaffinity re movaland immunoassay for rhodamine B in chilli powder［J］.InternationalJournalofFood Science and Technology，2010（45）：2589-2595.

［8］MICHALINA O，CHRISTOPHER T E.Development and validation of rapid disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Methyl Yellow and Rhodamine B dyes in foods［J］.Analyst，2011，136（11）：2403-2411.

［9］刘智宏，叶妮，郭文林，等.四环素类药物多残留酶联免疫检测方法［J］.中国农业科学，2009，42（1）：318-323.

［10］酶联免疫吸附法试剂（盒）（中华人民共和国医药行业标准）：YY T 1183—2010：8［S］.北京：中国质检出版社，2010.

［11］进出口食品中罗丹明B的检测方法：SNT 2430—2010：6［S］.北京：中国质检出版社，2010.

［12］SELVAKUMAR L S，THAKUR M S.Dipstick based immunochemiluminescence biosensor for the analysis of vitamin B 12 in energy drinks:A novel approach［J］. Analytica Chimica Acta，2012，722（7）：107-113.

［13］CORTINA M E，MELLI L J，ROBERTI M，et al.Electrochemicalmagneticmicrobeads-basedbiosensorfor point-of-careserodiagnosisofinfectiousdiseases［J］. Biosensors&Bioelectronics，2016（80）：24-33.

（编辑：莫婕）

Establishment and application of enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）for Rhodamine B

WANG Lin，WANG Xue，TIAN Jingmiao
（Beijing Purkinje General Instrument Co.，Ltd.，Beijing 101200，China）

A fast assay method of enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）for Rhodamine B（RhB）is established.The method is characterized into that IC50 is 1.3 ng/mL and the limit of detection is 0.786 ng/g.For the detected bean sauce by the method，its average recovery rate is 83%at the fortified concentration of 5 ng/g and 89%at the fortified concentration of 10 ng/g.For the detected chili sauce，its average recovery rate is 88%at the fortified concentration of 5 ng/g and 104%at the fortified concentration of 10ng/g.For the detected chili oil，its average recovery rate is 94%at the fortified concentration of 5 ng/g and 101%at the fortified concentration of 10 ng/g.For the detected chili powder，its average recovery rate is 82%at the fortified concentration of 5ng/g and 90%at the fortified concentration of 10ng/g.The intra assay CV of the ELISA method is 9.0%，and the inter assay CV is 10.5%.The ELISA method has no cross reaction with other common dyes.The method is featured with simple and convenient operation and accurate result，and it is applicable to rapid detection of a great number of Rhodamine B samples on site.

enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA）；Rhodamine B；bean sauce；chili sauce；chili oil；chili powder

A

1674-5124（2016）06-0060-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.06.014

2015-12-23；

2016-01-18

王琳（1980-），男，辽宁海城市人，工程师，硕士，研究方向为快速诊断检测技术的开发与应用。