UHPLC/LTQ Orbitrap MS法解析一种未知西地那非衍生物

周建良，周　哲，陈碧莲，马临科

(1.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州　310052；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海　201206)



UHPLC/LTQ Orbitrap MS法解析一种未知西地那非衍生物

周建良1，周哲2，陈碧莲1，马临科1

(1.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州310052；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海201206)

基于已知药物合成新的衍生物，以避开法定检验方法，是目前化学药物非法添加的趋势之一。本工作采用超高分辨的线性离子阱-静电场轨道阱质谱(LTQ Orbitrap MS)，在标示中药来源的样品中检出一种未知的西地那非衍生物。基于LTQ Orbitrap MS超高分辨率细分同位素的能力，并结合精确质量数，准确地获得了未知衍生物的元素组成。通过与西地那非和硫代艾地那非二级质谱的比较，进一步推断了该衍生物的结构，并对文献中离子的归属进行了纠正。经核磁共振解析，鉴定该衍生物为丙氧酚艾地那非(propoxyphenyl aildenafil)，系由艾地那非苯环上乙氧基衍生为丙氧基而成，其结构与质谱推断的一致。通过总结丙氧酚艾地那非的质谱裂解规律，并结合UHPLC/LTQ Orbitrap质谱分析方法，可有效地鉴定PDE-5型抑制剂及其衍生物，这是打击此类化合物非法添加的有力手段。

西地那非衍生物；丙氧酚艾地那非；线性离子阱-静电场轨道阱质谱(LTQ Orbitrap MS)；非法添加

枸橼酸西地那非、他达拉非和伐地那非是美国FDA批准上市的磷酸二酯酶5型(PDE-5)抑制剂类药物，可用于治疗男性勃起功能障碍疾病[1]。目前，在补肾壮阳类中药制剂及保健食品中非法添加PDE-5抑制剂类化学药物的现象屡见不鲜，且有添加其衍生物的发展趋势[2-3]。国家食品药品监督管理局于2009年出台了药品补充检验方法，用于监管中药及保健食品中非法添加西地那非等11种PDE-5型抑制剂的现象[4]。为了逃避药品监督检验，一些不法分子开始合成和添加处于监管之外的新型PDE-5抑制剂衍生物，如艾地那非[3]、硫代西地那非[5]、1-[4-丙氧基-3-[5-(6, 7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4, 3d]嘧啶)]苯磺酰]-4-甲基哌嗪[6]等。

有关PDE-5型抑制剂及其衍生物的检测多采用液质联用法，包括高效液相色谱-三重四极杆质谱法(HPLC/QQQ-MS)[2-3,5,10]和高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(HPLC/QTOF-MS)[6-8]等。其中，QQQ-MS法灵敏度高、选择性好，但不能对化合物进行精确分子质量的测定，在定性方面尚有欠缺；QTOF-MS法能提供化合物精确的分子质量，在定性分析中应用广泛，但它一般只能提供二级质谱分析，无法实现复杂的化合物裂解分析。近年来，线性离子阱-静电场轨道阱-高分辨质谱(LTQ Orbitrap MS)因兼具离子阱和超高分辨质谱平行检测的能力，在化合物的定性分析方面备受关注。LTQ Orbitrap MS的分辨率高达100 000，而且能对目标物进行多级质谱分析，因此可在没有标准物质的情况下，通过精确质量数和多级碎片信息对未知物进行快速筛查与结构确认[11]。

本工作针对在“强力V1型羊肚菌补肾精华粉”(标示来源为乌青莲、冬虫夏草、淫羊藿、达米阿那和玛卡)样品中发现的一种新型西地那非衍生物，采用超高分辨的线性离子阱-静电场轨道阱质谱对其进行结构解析，并通过核磁共振(NMR)进行结果确证，总结质谱裂解规律，希望为鉴定PDE-5型抑制剂及其衍生物提供新的方法参考。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

LTQ Orbitrap Velos Pro快速液相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher公司产品；LC-20AP高效液相色谱仪：日本岛津公司产品；500 MHz核磁共振仪：德国Bruker公司产品；XPE205电子分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司产品。

伐地那非(Vardenafil, 1)、那红地那非(Noracetildenafil, 2)、红地那非(Acetildenafil, 3)、羟基豪莫西地那非(Hydroxyhomosildenafil, 4)、枸橼酸西地那非(Sildenafil citrate, 5)、豪莫西地那非(Homosildenafil, 6)、氨基他达拉非(Aminotadalafil, 7)、他达拉非(Tadalafil, 8)、硫代艾地那非(Thioaildenafil, 9)、伪伐地那非(Pseudovardenafil, 10)和那莫西地那非(Norneosildenafil, 11)等11种PDE-5型抑制剂对照品：纯度均大于98.0%，加拿大TLC Pharma Chem 公司产品；强力V1型羊肚菌补肾精华粉样品：来自食品药品监督管理局市场抽样；乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯，美国Merck公司产品；实验用水：由Milli-Q系统制备。

1.2实验条件

1.2.1色谱条件Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；柱温：35 ℃；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～10 min、20%～40%B，10～15 min、40%～90%B，15～18 min、90%B；流速：0.3 mL/min；进样体积：1 μL。

1.2.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)正离子模式，高分辨检测模式(FTMS)，分辨率60 000(FWHM)；离子源温度：350 ℃；鞘气流速：35个单位；辅助气流速：10个单位；反吹气流速：0个单位；喷雾电压：4.0 kV；毛细管温度：300 ℃；一级全扫描范围m/z300～600；二级质谱采用HCD和CID两种碎裂方式，HCD碰撞电压50%、CID碰撞电压35%。

1.3溶液制备

对照品溶液的制备：取适量上述11种对照品溶液，加入甲醇溶解,并稀释至约1 mg/L。

供试品溶液的制备：取0.1 g样品粉末，置于50 mL容量瓶中，加入约40 mL甲醇，超声10 min，冷却至室温；加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤；取适量滤液，用甲醇稀释100倍，摇匀，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，待UHPLC/LTQ Orbitrap MS分析。

1.4样品化合物的纯化

Kromasil C18制备色谱柱(10 mm×250 mm×10 μm)，流动相为乙腈-水溶液(45∶55，V/V)，流速5 mL/min，检测波长230 nm。

取1 g样品，加入20 mL甲醇，超声10 min，过滤，取适量滤液进样分析，收集主色谱峰成分，减压蒸发除去溶剂，即得纯化样品。

2　结果与讨论

2.1未知衍生物的发现和结构解析

对照品溶液和供试品溶液的总离子流图示于图1。在供试品溶液中检测到1个保留时间和精确分子质量与11个对照品均不同的化合物(N)m/z503.243 67，该未知化合物的质谱图示于图2。可见，未知化合物的M+2同位素离子出现2个裂峰，且M+2同位素离子的相对丰度约为4%。在超高分辨质谱中(分辨率≥60 000 FWHM)，含S化合物的M+2同位素离子出现2个裂峰，分别为34S和13C2+18O(或只含13C2)，且含S的个数与其相对丰度正相关[13]。据此，可推断该化合物含有S元素，且只含1个S，其分子式可能为C24H34N6O4S，相对分子质量误差为0.338×10-6，样品同位素与理论值一致。

注：1.伐地那非；2.那红地那非；3.红地那非；4.羟基豪莫西地那非；5.枸橼酸西地那非；6.豪莫西地那非；7.氨基他达拉非；8.他达拉非；9.硫代艾地那非；10.伪伐地那非；11.那莫西地那非图1　对照品溶液(a)和供试品溶液(b)的总离子流图 Fig.1　Total ion chromatograms of standard compounds (a) and sample (b)

在二级质谱分析中，该化合物与西地那非和硫代艾地那非有相同的碎片离子，西地那非和硫代艾地那非的结构式于图3，其HCD、CID质谱图分别示于图4和图5，此结果表明该化合物可能是PDE-5型抑制剂的衍生物。在HCD碎裂方式下，未知化合物与西地那非的共有碎片离子有m/z299.11、283.11和255.12。根据Mass FrontierTM7.0 软件分析，m/z299.11和m/z283.11离子均由西地那非苯环(C环)上的C—S键和乙氧基发生裂解和重排产生，离子m/z255.12则在m/z283.11离子的基础上继续重排产生。此外，HCD二级质谱中两组离子(未知化合物m/z325.16 C18H21N4O2+→西地那非m/z311.15 C17H19N4O2+，未知化合物m/z391.14 C18H23N4O4S+→西地那非m/z377.12 C17H21N4O4S+)均相差1个CH2单元，表明该未知化合物在西地那非除D环外的结构基础上多1个CH2单元，且该CH2单元很有可能增加在A环的丙烷基或C环的乙氧基上。因未知化合物与西地那非有相同的m/z299.11和m/z283.11离子，说明A环和B环及其基团并未发生衍生化改变，由此推断CH2单元增加在C环的乙氧基上，即乙氧基衍生为丙氧基。

图2　未知化合物(a)和在60 000 FWHM分辨率下理论化学式C24H34N6O4S (m/z 503.243 50) (b)的质谱图Fig.2　MS spectra of sildenafil analogue (a) and C24H34N6O4S (m/z 503.243 50) by computational simulation at high resolution mass of 60 000 FWHM (b)

图3　西地那非和硫代艾地那非的结构式Fig.3　Chemical strutures of sildenafil and thioaildenafil

未知化合物与硫代艾地那非相比，在HCD二级质谱中具有相同的m/z113.10离子，该离子由硫代艾地那非D′环上的N—S断裂产生；而在CID二级质谱中具有相同的m/z177.06离子，该离子由C’环的C—S断裂产生。因此，推断该未知化合物具有3，5-二甲基哌嗪-1-基磺基结构。

综上，推断该化合物的结构与西地那非相比，其苯环的乙氧基衍生为丙氧基，并且4-甲基哌嗪衍生为3，5-二甲基哌嗪。

图4　HCD模式下，未知化合物(a)、西地那非(b)和硫代艾地那非(c)的二级质谱图Fig.4　MS/MS spectra of sildenafil analogue (a), sildenafil (b) and thioaildenafil (c) at HCD mode

图5　CID模式下，未知化合物(a)和硫代艾地那非(b)的二级质谱图Fig.5　MS/MS spectra of sildenafil analogue (a) and thioaildenafil (b) at CID mode

2.2NMR结构确证

通过1H、13C和DEPT、HMBC谱对该未知化合物进行结构解析，其氢谱示于图6。经与文献[14]比较，确定该衍生物为丙氧酚艾地那非(propoxyphenyl aildenafil)，其质谱裂解规律示于图7。在NMR结构确证的基础上，对该衍生物的裂解规律进行解析，并对HCD和CID二级质谱的主要碎片离子进行归属。结果表明，该化合物的结构与本实验推断的结构一致。

图6　未知化合物的氢谱Fig.6　1H spectrum of sildenafil analogue

2.3讨论

准确判定未知化合物的化学式是结构解析的重要部分。在高分辨质谱中，通过精确分子质量计算化学式时，若限定的组成元素种类和数量不对，则无法得到准确的化学式。本实验利用LTQ Orbitrap MS的超高分辨率准确判断了未知衍生物中含有S元素，且只含1个S，结合精确质量数和同位素丰度比对，获得了该化合物的化学式，这为后续的结构解析奠定了基础。

该衍生物曾在新加坡的某保健品中被发现，相关文献[14]将样品中的m/z299.113 0离子归属为C15H15N4OS+(m/z299.096 11)，与实测值的质量误差达5.65×10-5，远超过了可接受的范围(±5×10-6)。本实验经精确分子质量及M+2同位素离子丰度比较，推断该离子为C15H15N4O3+(m/z299.113 87)，与本实验样品中实测值的质量误差仅为2.67×10-7，与文献报道实测值的误差为-2.91×10-6，均在可接受的范围之内，其质谱图示于图8。

图8　西地那非衍生物的子离子m/z 299.11(a)和在60 000 FWHM分辨率下理论化学式与C15H15N4OS+(m/z 299.096 11)(c)离子的质谱图Fig.8　MS spectra of product ion (m/z 299.11) of sildenafil analogue (a) and C15H15N4O3+ (m/z 299.113 87) (b), C15H15N4OS+ (m/z 299.096 11) (c) by computational simulation at high resolution mass of 60 000 FWHM

3　结论

采用LTQ Orbitrap超高分辨质谱对(标示)中药来源样品中的未知化合物进行结构解析，推断其为西地那非类衍生物propoxyphenyl aildenafil，并经1H、13C和DEPT、HMBC谱对其进行结构确证。该衍生物由艾地那非苯环上的乙氧基衍生为丙氧基而来，因目前在国内外鲜有报道，对其有效性和安全性更是知之甚少，值得引起重视。实验总结了西地那非、硫代艾地那非和propoxyphenyl aildenafil的质谱裂解规律，发现西地那非类化合物主要产生m/z377.12、311.15、299.11和283.11等特征离子；当西地那非B环发生硫代时，会产生m/z315.09和299.09等特征离子；此外，若在未知化合物的二级质谱中出现m/z391.14和325.16等离子时，应考虑苯环上的乙氧基衍生为丙氧基的可能性。

迄今为止，已合成和报道的PDE-5型抑制剂及其衍生物有80余种，有非法添加报道的超过30种，将来可能还会出现新的衍生物。UPLC/LTQ Orbitrap质谱分析方法可有效鉴定PDE-5型抑制剂及其衍生物，是打击此类化合物非法添加的有力手段。本实验总结的该类化合物的裂解规律可为PDE-5型抑制剂的新型衍生物的鉴定提供参考。

致谢：感谢浙江工业大学楚楚博士，浙江省药品化妆品审评中心张耀博士在NMR测定和解析中给予的帮助。

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Identification of an Unknown Derivative of Sildenafil by UHPLC/LTQ Orbitrap MS

ZHOU Jian-liang1, ZHOU Zhe2, CHEN Bi-lian1, MA Lin-ke1

(1.ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl,Hangzhou310052,China;2.ThermoFisherScientific(China)Co.,Ltd,Shanghai201206,China)

It is a trend for illegal addition that new derivatives of known drugs are synthesized and used to avoid the statutory test. By using LTQ Orbitrap MS, an unknown derivative of sildenafil was found in a sample which was marked as traditional Chinese medicines extraction. The accurate formula of the unknown derivative was C24H34N6O4S, which was obtained based on the separating capacity of isotopic peaks of ultra-high-resolution by LTQ Orbitrap MS and accurate mass measurement. The structure of the unknown derivative was derived by comparison of the MS2spectra with those of sildenafil and thioaildenafil. The unknown derivative had the same fragment ions with sildenafil (m/z299.11,m/z283.11 andm/z255.12) and thioaildenafil (m/z113.10 andm/z177.06) in the MS2spectra. These fragment ions were assigned with the aid of Mass FrontierTMsoftware. Furthermore, the assignment of one fragment ion (m/z299.11) in literature was corrected in this paper by comparison of the accurate mass and isotopic abundance. The unknown derivative was finally identified as propoxyphenyl aildenafil by1H,13C, DEPT and HMBC NMR, which proved that it is correct for the derived structure of the unknown derivative by LTQ Orbitrap MS. This derivative was obtained by substituting the ethoxy group of the benzene ring moiety of aildenafil to the propoxy group. The proposed fragmentation pathway of propoxyphenyl aildenafil was summarized and the analytical method based on UHPLC/LTQ Orbitrap MS was developed. This method can identify the PDE-5 inhibitors and their derivatives, which could be a power tool to control the illegal addition.

sildenafil analogue; propoxyphenyl aildenafil; LTQ Orbitrap MS; illegal addition

2016-03-24;

2016-05-15

周建良(1982—)，男(汉族)，浙江人，副主任中药师，从事中药活性成分研究及质量评价。E-mail: cpuzhou@163.com

马临科(1978—)，男(汉族)，浙江人，副主任中药师，从事中药质量评价。E-mail: malinke@zjyj.org.cn

O657.63

A

1004-2997(2016)05-0422-09

10.7538/zpxb.2016.37.05.0422