超高效液相色谱仪测定乳粉中三聚氰胺的能力验证
2016-10-15阳泉市质量技术监督检验测试所余志明
● 阳泉市质量技术监督检验测试所 余志明
超高效液相色谱仪测定乳粉中三聚氰胺的能力验证
● 阳泉市质量技术监督检验测试所余志明
超高效液相色谱仪分析是20世纪60年代中期提出并发展起来的新型光谱分析技术，它具有超强分离能力、超高分离速度、超高灵敏度、选择性高、简单方便的方法转换等优点。
超高效液相色谱仪 三聚氰胺 能力验证
前言
随着科学技术的进步，液相色谱用户对液相色谱技术的要求也不断提高，他们需要“更快地得到更好的结果”。因此，超高效液相色谱（UltraPerformance LC）概念的提出也就十分自然；简单的说：UPLC（超高效液相色谱）是用HPLC（高效液相色谱）的极限作为自己的起点，把分离科学推向一个新领域。
超高效液相色谱应用范围广泛，主要应用类型为高沸点中分子，高分子有机化合物，离子性无机化合物，热不稳定具有生物活性的生物分子。
三聚氰胺（分子式C3N6H6）是一种重要的氮杂环有机化工原料，具有肾毒性。三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而普通的凯氏定氮法测定乳粉及食品中的蛋白质含量时无法区分氮元素来源于蛋白分子还是三聚氰胺的氮杂环，因而一些厂商为了降低成本而添加这种化工原料，以提高产品中蛋白质含量检测值。因此，才衍生了乳制品中三聚氰胺的检测方法。三聚氰胺是一种有机化合物，因此采用超高效液相色谱法检测。
检验依据
参照GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》第一法
检验原理
样品用三氯乙酸溶液和乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用超高效液相色谱仪测定，外标法定量。
相关仪器及试剂
1.仪器和设备
超高效液相色谱仪：美国沃特世Waters Acquity UPLC
检测器：光电二极管阵列（PDA） ，此检测器属于固定波长紫外检测器
色谱条件：色谱柱Acquity UPLC BEH HⅠLⅠC 1.7μm柱温35℃
流动相：乙腈-乙酸铵溶液（0.02 mol/L），体积比为97：3
流速：0.5 mL/min
进样量：2 μL
进样器为自动进样器，波长：210 nm。
电子天平：精确度为0.0 001 g，上海精密仪器仪表有限公司
离心机：高速冷冻离心机，最高转速16 000 r/min
真空过滤装置：300 mL
具塞塑料离心管：50 mL
超声波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超声波仪器有限公司
固相萃取装置：天津奥特赛恩斯仪器有限公司
氮气吹干仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司
真空泵：天津奥特赛恩斯仪器有限公司
漩涡混合器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
超纯水机：重庆摩尔水处理设备有限公司
2.试剂与材料
甲醇：色谱纯
乙腈：色谱纯
乙酸铵：分析纯
氨水：含量为25%～28%
三氯乙酸：分析纯
三聚氰胺标准品：CAS108-78-01，纯度大于99.0%，来源于中国计量科学研究院
阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL
氮气：纯度≥99.999%
微孔滤膜：0.2μm，有机相、无机相。定性滤纸。
实验用水为超纯水，阻值在18 MΩ以上。
3.试剂的配制
（1）标准溶液的配制（表1）
三聚氰胺标准储备溶液（浓度为1 mg/mL）：准确称取100 mg（精确至0.1 mg） 三聚氰胺标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，混匀，即配制成浓度为1 mg/mL的三聚氰胺标准储备溶液，于4℃避光保存。
三聚氰胺标准工作液：分别吸取三聚氰胺标准储备溶液（1 mg/mL）0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，放入50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，相当于浓度为0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的三聚氰胺标准工作液，标准工作液经0.2 μm有机相滤膜过滤。
（2）流动相的配制
乙腈：色谱纯。
乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水定容至1 000 mL，溶解，经0.2 μm水系滤膜过滤（现用现配）。
（3）其它试剂的配制
氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5 mL氨水和95 mL甲醇，混匀后备用。
三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10 g三氯乙酸于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
甲醇水溶液：准确量取50 mL甲醇和50 mL水，混匀后备用。
阳离子交换固相萃取柱：使用前依次用3 mL甲醇、5 mL水活化。
表1 标准溶液的配制
样品的处理
称取样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，用超声波提取10 min，再振荡提取10 min后，以10 000 r/min转速、温度5℃、离心10 min，离心沉淀后，取上清液经三氯乙酸溶液湿润的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL超纯水混匀后，转移至固相萃取柱中，依次用3 mL超纯水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL /min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物用1 mL流动相定容，漩涡混合1 min，经0.2 μm有机相滤膜过滤，供UPLC测定。
空白实验
除了不称取样品外，均按照样品的处理方式进行前处理。
仪器测定
1.标准曲线的绘制
将浓度为0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/ mL、80 μg/mL、100 μg/mL的三聚氰胺标准工作液在选定的色谱条件下浓度由低到高进行检测分析，以峰面积A对浓度C绘制标准工作曲线。峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性相关系数r=0.999 743，具体数值见表2。
表2 标准曲线的数值
2.样品检测
依次将处理好的空白、样品在与三聚氰胺标准工作液同样的色谱条件下进行检测分析，即可得出空白、样品的浓度值，然后进行结果计算。
3.结果计算
计算公式：已具备乳制品中三聚氰胺的检测能力。
注意事项
1.流动相使用前要经过脱气和过滤处理。
2.使用前后都要清洗柱子，以防柱压升高。
3.三聚氰胺标准工作液配制的准确度直接影响标准工作曲线的线性关系，从而影响样品的检测结果。
4.实验用水为超纯水，阻值在18 MΩ以上。
5.三聚氰胺标准储备溶液要求4℃避光保存，以保证标液的稳定性。
6.所有三聚氰胺标准工作液和样品进仪器前都要经过0.2 μm有机相微孔滤膜过滤。
7.色谱柱Acquity UPLC BEH HⅠLⅠC 1.7 μm在不工作时，要用100%甲醇注满。
8.整个固相萃取过程流速不超过1 mL /min。
9.三聚氰胺标准工作液要用流动相定容，并用0.2 μm有机相微孔滤膜过滤。
10.乙酸铵溶液要现用现配。■
X——样品中三聚氰胺的含量，单位是毫克每千克（mg/kg）
C——进样中的三聚氰胺的浓度，单位是微克每毫升（μg/mL）
C0——空白实验三聚氰胺的浓度，单位是微克每毫升（μg/mL）
m——样品的质量，单位是克（g）
V1——样品的定容体积，单位是毫升（mL）
V2——取样体积，单位是毫升（mL）
V3——稀释定容体积，单位是毫升（mL）
V1=25 mL V2=5 mL V3=1 mL
检测结果与结论
经计算，检测结果为54.91 mg/kg ，在全省实验室能力验证的允差范围内。结论是阳泉市质量技术监督检验测试所
