分光光度计计量检定过程分析与评定

崔骊

摘要：目的 通过分析分光光度计检定中的各种因素，评估分光光度计检定结果的正误。方法 计算检测装置的不确定度、稳定性、重复性，评估分光光度计检定结果的正误。结果 经过分析被检仪器设置和标准装置的不确定度、稳定性、重复性对检定的影响，排除了检定中影响检定结果的各种因素。结论 经过分析和评定，注意设置被检仪器，检定装置满足量传要求，按照规程操作可以确保分光光度计的量值准确可靠。

关键词：分光光度计；检定；不确定度；重复性

分光光度计是医院实验室常用的分析仪器，主要功能是对物质进行定量、定性的分析，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量[1]。通常使用氧化钬滤光片，通过全波段扫描，找到其吸光度出现波谷的波长，然后与定值进行比较，可得到波长示值误差的数值。其工作原理是采用可以产生多个波长的光源，通过分光装置，产生特定波长的光源，光源透过测试样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，最终转化成样品的浓度，根据计算规律样品的吸光值与样品的浓度成正比[2]。

1 测量标准概述

1.1测量标准的组成 检测波长采用低压汞灯波长标准器、H849氧化钬滤光片一块、P749镨钕滤光片一块、G693干涉滤光片三块、W062近红外滤光片五块；检测透射比采用三块Z741可见光透射比滤光片、三块J566紫外光透射比滤光片；检测杂散辐射率采用三块ZA1105杂散光滤光片。

1.2方法 采用低压汞灯波长标准器、氧化钬滤光片、镨钕滤光片检定波长；采用金属石英滤光片检定透射比准确度与重复性，采用杂散光滤光片检定杂散辐射率[3]。

将标准物质垂直放入被检仪器的样品光路中，读取标准物质的光度测量值，使用汞灯时，将汞灯置于光源室，使汞灯的光入射到单色器入射夹缝，选择能量测量方式，测量能量最大时对应的峰值波长，检定被检仪器的波长准确度及重复性。

2 检定中应注意的问题

2.1仪器性能判断 在JJG178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计》检定规程中，为了便于描述仪器的计量性能要求，将仪器的工作波长分为A段（190nm～340nm）、B段（340nm～900nm）和C段（900nm～2600nm），并把仪器性能从高到低划分为I级 、I级、II级、IV级，共4个级别[4]。因此在检定证书中应给出每项指标在每个波段的仪器级别，以方便使用者对仪器性能的判断。

2.2基线平直度检定 基线平直度是指扫描透射比为100和0时基线倾斜或弯曲的程度。如果基线平直度差，会使吸收峰之间的比值发生变化，给仪器定性分析造成困难。导致基线平直度差的主要原因是光学系统失调，两光束不平衡，而仪器受震动、光源位置变动都会引起光学系统故障[5]。因此在测量时要让仪器充分预热，并设置仪器光谱带宽为2nm，并且在仪器遮光罩关闭后稳定2min后再进行波长扫描。

2.3调整光谱带宽 检测噪声、漂移、最小光谱带宽和基线平直度时需要调整光谱带宽。光栅型仪器中当狭缝宽度小于衍射宽度时，光谱带宽由衍射宽度决定；当狭缝宽度大于衍射宽度时，光谱带宽由狭缝宽度决定，狭缝越小，得到的单色光越纯，但光的强度降低了。目前，有很多仪器为固定光谱带宽，容易使光电流的噪声偏大[6]。

2.4选择扫描速度 检测波长最大允许误差时，需要对氧化钬滤光片进行波长扫描。设定波长范围时要包含与标准值对比的波峰波谷，通过仪器说明书确定仪器波长重复性，设置扫描速度时注意使采样间隔小于波长重复性。如果采样间隔不能设定，则应设定扫描速度小于120nm/min。进行基线平直度测量时，全波段扫描的速度应选择采样间隔为1nm的速度，若不能设置采样间隔，则可选择扫描速度为400～800nm/min。

3 测量标准不确定度评定

因为测量标准的不确定度、稳定性、重复性都可以影响分光光度计的检定结果，所以需要分析影响因素并进行评定。

3.1低压汞灯波长标准器检测波长的测量不确定度 低压汞灯波长标准器的辐射光谱由汞原子内部电子跃迁来确定，外部环境的变化对其辐射波长的影响可忽略不计，在200～700nm波长范围内，波长扩展不确定度为0.01nm。

3.2滤波片标准物质检定时的测量不确定度 标准滤波片的标准物质证书注明：紫外光区透射比滤光片标准物质和光谱中性滤光片标准物质的透射比不确定度为：U=0.5%（k=2.45）。氧化钬滤光片标准物质和镨钕滤光片标准物质峰值波长的不确定度为：U=0.3nm（k=2.10）。干涉滤光片标准物质峰值波长的不确定度为：U=1nm（k=2.10）。杂散光滤光片标准物质的吸光度不确定度为：U=0.1A（k=2.20）。近红外滤光片标准物质峰值波长的不确定度为：U=1nm（k=2）。标准物质在研制、制备过程中已对其复现的量值进行了不确定度分析，故此套标准装置的不确定度不再评定

4 测量标准重复性评定

将722S型紫外可见分光光度计调至440nm处，对准标准金属石英滤光片，在短时间内观察透射比6次，用观察值的实验标准偏差Sn（X）表征测量标准的重复性。测量值Xi和Sn（X）计算如下：

X=19.36%

Sn（X）=■ =■=0.0077%

相对值：Sn（X）/X=0.0077%/19.36%=4.0×10-4；Sn（X）/小于■uc，符合要求。

5 测量标准稳定性评定

镨钕滤光片标准物质、 氧化钬滤光片标准物质、干涉滤光片标准物质和杂散光滤光片标准物质都是国家二级标准物质，在标准物质研制过程中已经进行了稳定性实验，其稳定性经过验证和审批，因此无需验证。

透射比滤光片标准物质的稳定性需要评定：每隔一个月，在相同条件（440nm、（23±5）℃）下测量透射比一次。取n=6个测量值的算术平均值（Xn）i作为一个观察结果。共观察m=4次，用4次Xm的实验标准偏差Sm定量表征测量标准的稳定性。

Xm=■（Xn）i/4=19.36

Sm=■ =■=0.0081

相对值：■=■=0.00042，小于uc符合要求。

6 测量标准不确定度的验证

将标准器中紫外光区透射比滤光片标准物质送往有资质的单位溯源，用其出具的校准值y0与原出厂认定证书的标准值y进行比较结果如下：

标准值y：19.36%

验证值y0：19.39%

■=■=0.15%

7 结论

检定分光光度计的目的是为了确定被测量的量值，再根据规程判断仪器的测量结果是否符合要求，以确保其质量安全[7]。在检定过程中应注意各种因素对检测结果的影响，通过分析和评定，可以计算出标准检定装置的测量不确定度、测量重复性、稳定性的不确定度，并按照规程规定判断其对结果的影响。经过实驗证明，分光光度计检定装置的测量不确定度、测量重复性、稳定性符合要求，不影响检定结果。

参考文献：

[1]孙江晖，龙燕.荧光分光光度计检定的不确定度分析[J].计量与测试技术，2012，39（1）：50-51.

[2]黄林雪.紫外可见分光光度计检定过程中影响因素分析及对策研究[J].中国化工贸易，2014，6（20）：160-161.

[3]陆璐，陈骥宁.紫外、可见分光光度计波长和透射比示值误差的测量不确定度评定[J].计量与测试技术.2014，41（3）：77-80.

[4]段亚博，徐芳英.可见分光光度计检定中常见问题分析[J].商品与质量·学术观察，2014，（12）：311.

[5]钱骥.检定紫外可见分光光度计应注意的问题[J].中国计量，2012，（8）：82.

[6]王平宜.分光光度计检定和使用中应注意的问题[J].中国计量，2012，（3）：81.

[7]谢康.浅谈分光光度计检定过程中应注意的事项[J].中国新技术新产品，2012，（8）：161.

编辑/安桦