荧光定量PCR检测猪肝中猪链球菌2型的基因组DNA提取方法的比较

凌淑萍 赵健 陈国 叶宇飞 许秀琴 吕燕 吴银良

摘要[目的]在人工布菌猪肝中评估溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法提取猪链球菌2型基因组DNA在荧光定量检测中的应用效果，为猪链球菌2型的荧光定量检测选择合理的基因组DNA提取方法提供试验依据。[方法]采用溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法分别提取人工布菌猪肝样本中猪链球菌2型基因组DNA，通过荧光定量PCR技术检测猪链球菌2型的相对含量。[结果]利用荧光定量方法能够检测到猪链球菌2型。该方法可以最低检测到12 CFU/g的猪链球菌，特异性良好，标准曲线方程为y=-3.185 9x+39.901 0。在人工布菌猪肝样本中，溶菌酶-苯酚法在qPCR实验中检测猪链球菌2型较灵敏。[结论]溶菌酶-苯酚法在猪肝样品中提取基因组DNA效果较好；试剂盒法在细菌纯培养物中提取基因组DNA具有安全、高效等优点。

关键词 猪链球菌2型；基因组DNA；qPCR检测

中图分类号 S851.34+7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-168-03

Abstract[Objective]To evaluate the difference between lysozymephenol method and purification kit method in extracting the Streptococcus suis type 2 from pig liver， and to provide experimental basis for selecting an appropriate genomic DNA extraction method in the application of fluorescent quantitative detection of Streptococcus suis type 2.[Method]Both lysozymephenol method and purification kit method were used to extract the genome DNA of Streptococcus suis type 2 from pig liver samples. The relative contents of Streptococcus suis type 2 were detected by fluorescent quantitative PCR technology.[Result]Fluorescent quantitative detection could detect the Streptococcus suis type 2. This method could detect at least 12 CFU/g Streptococcus suis， with good specificity. The equation of standard curve was y=-3.185 9x+39.901. Lysozymephenol method was more sensitive in qPCR test on the detection of Streptococcus suis type 2.[Conclusion]Lysozymephenol method is better in extracting genomic DNA from pig liver samples. However， purification kit method is widely applied in the fluorescent quantitative detection due to the advantages of safety and efficiency in extraction of genomic DNA.

Key words Genomic DNA； Streptococcus suis type 2； qPCR detection

猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，根据其菌体荚膜多糖的多样性，猪链球菌可分为35个血清型，其中以猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，SS2）致病力最强，也是最常见的致病血清型[1-2]。它主要引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎等，各年龄段猪均可感染猪链球菌病。近年来，在我国江苏、四川等地区均有暴发流行，已经成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病。同时，该病还可以感染养猪相关从业人员，引起细菌性败血症、休克、脑膜炎、永久性听力丧失，甚至死亡，给养猪业及社会公共卫生构成严重威胁[3]。

目前，猪链球菌2型的检测包括细菌培养、生化試验、乳胶凝集试验和qPCR等分子生物学检测方法，与传统的方法相比，qPCR方法能够快速、准确地检测猪链球菌2型，已被广泛应用于猪链球菌病的检测与诊断方面[4]。提取细菌基因组DNA的质量严重影响qPCR方法检测结果的准确性。笔者在人工布菌猪肝中比较了2种常用的细菌基因组DNA提取方法溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法，以荚膜多糖（cps）基因cps2j片段作为靶基因，评估基因组DNA在荧光定量PCR检测中的应用效果，以期为荧光定量PCR检测猪链球菌2型的应用中合理选择基因组DNA提取方法提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。猪链球菌2型ATCC43765，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；金黄色葡萄球菌ATCC6538、单增李斯特菌ATCC29212、沙门氏菌ATCC14028、大肠埃希氏菌ATCC25922、乙型溶血性链球菌ATCC21059，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器。脑心浸液肉汤、琼脂粉，均购自青岛海博生物技术有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA（上海生工）；Premix Ex TaqTM 试剂盒（TaKaRa）；steponeplusTM定量PCR仪（ABI公司）；溶菌酶（BIOSHARP）；蛋白酶K（上海生工）。

1.2 引物和TaqMan探针

根据GenBank数据库中公布的猪链球菌2 型csp2j基因序列鉴定菌种参考基因序列（登录号：JX986792.1），使用Beacon Designer 7设计引物和探针，均交由life公司合成。探针的5′端标记FAM，3′端标记BHQ1。具体引物和探针序列见表1。

1.3 细菌计数

猪链球菌2型标准菌株接种于脑心浸液肉汤，37 ℃下培养24 h。取1 mL培养液置于9 mL生理盐水中，摇匀后依次做10倍梯度稀释；然后，取适当稀释度的菌液1 mL置于培养皿中，加入含1.5%琼脂的脑心浸液肉汤，混合均匀，每个稀释度的细菌做2个平行，37 ℃下培养24 h，取合适细菌生长数的培养皿，计算每毫升菌落形成单位（Colonyforming units，CFU）。

1.4 荧光定量PCR

1.4.1 人工布菌猪肝中猪链球菌2型基因组DNA的提取。以无菌操作称取2 g猪肝，放入研钵内，然后再加入5 mL 菌液稀释液，充分研磨混匀，取100 μL研磨液进行DNA提取。①柱式纯化试剂盒法。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体方法参照使用说明书；②溶菌酶-苯酚法。研磨液中添加20 mg/mL溶菌酶（20 mmol/L pH 8.0的Tris、2 mmol/L Na2EDTA、1.2% Triton），使终浓度达到10 mg/mL，37 ℃下保温1 h，添加20 mg/mL蛋白酶K，使终浓度达到0.1 mg/mL，37 ℃下保温30 min，加入0.75 mL 5 mol/L的NaCl，混匀后，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提1次，13 000 g离心5 min，将上清转移至干净离心管中，再用等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提，静止10 min，13 000 g离心5 min，上清转移至干净离心管，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，静止5 min后，13 000 g离心10 min沉淀DNA，75%乙醇润洗，吸干，用50 μL TE溶解，备用或于-20 ℃下保存。另外，取2 g猪肝，加入5 mL生理盐水为阴性对照，取100 μL纯菌液为阳性对照，都采用试剂盒方法提取基因组DNA。

1.4.2

荧光定量PCR。PCR 扩增反应在Stepone Plus上进行，PCR反应体系（20 μL）：Premix Ex TaqTM 10 μL、10 μmol/L引物各0.4 μL、Probe 0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、DNA模板2 μL、超纯水6.0 μL。荧光定量PCR反应条件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 1 s，60 ℃ 20 s，40个循环，在每个循环的60 ℃时收集荧光信号。

1.4.3 特异性试验。利用金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌作为特异性试验的对照组进行试验。

1.4.4

标准曲线的绘制与灵敏度检测。取1 mL 37 ℃过夜培养的菌液，用生理盐水进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释，取稀释度10-5、10-6的猪链球菌2型进行细胞计数试验，采用柱式纯化试剂盒法提取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7细菌基因组，通过荧光PCR进行灵敏度检测。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的猪链球菌2型基因组DNA 进行定量扩增，扩增曲线如图1所示。取10-5、10-6稀释度的猪链球菌2型菌进行细胞计数，结果表明10-5稀释度的细菌多不可计，10-6稀释度细菌数为125和115 CFU。以起模板数的对数值为X轴，以Ct值为Y轴，绘制标准曲线，根据标准曲线可得到标准曲线方程y=-3.185 9x+39.901 0（R=0.999 9）（图2）。

2.2 灵敏度检测

根据阳性对照细菌数计算拷贝数，检测倍比稀释的阳性对照，结果发现此体系最低可检测到12 CFU/g（图3），Ct值为36.122，但是该浓度下的变异系数大于3%，重复性和稳定性都较差（P<0.05），因此35≤Ct≤40的结果判为可疑。

2.3 特异性试验

利用金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌作为特异性试验的对照组进行试验， 结果发现该方法能够特异地检测出猪链球菌2型，而其他的对照组结果均显示为阳性。这说明该体系具有良好的特异性。

2.4 人工布菌猪肝样品DNA提取效果的检测

将2 g猪肝加入5 mL菌液稀释液充分研磨混匀，取100 μL研磨液进行提取试验。分别采用溶菌酶-苯酚法与柱式纯化试剂盒法提取基因组DNA，阳性对照为2 mL生理盐水中加入5 mL的菌稀释液，取100 μL菌稀释液进行提取试验。从图4可以看出，柱式纯化试剂盒法和溶菌酶-苯酚法的荧光定量检测Ct值分别为33.418和28.978。阳性对照Ct值为27.412，阴性对照无扩增曲线。这表明在猪肝人工布菌样品中提取DNA采用溶菌酶-苯酚法的效果优于柱式纯化试剂盒法。

3 讨论与结论

1998年和2005年分别在我国江苏省和四川省发生猪链球菌2型2次大规模的暴发，并伴随着猪群大规模的链球菌中毒性休克綜合症和异常升高的死亡率[5-7]，引起了公众对猪链球菌2型检测的极大关注。加强对猪链球菌尤其是对猪链球菌2型的检测力度，对于预防和控制猪链球菌病具有重要的意义。cps是猪链球菌主要的毒力因子，具有很高的种特异性，根据cps的抗原性，猪链球菌可以分为33个血清型，csp2j常被作为检测猪链球菌2型的靶基因[8]。

在日常檢测工作中发现，在处理肉类样品时，使用柱式纯化试剂盒法提取细菌基因组DNA的效果并不十分理想，而细菌基因组DNA提取的质量关系到qPCR方法检测的准确性。该试验采用常用的溶菌酶-苯酚法和柱式纯化柱式纯化试剂盒法提取人工布菌猪肝样品中猪链球菌2型基因组DNA，使用荧光定量qPCR评估提取效果。目前检测猪样品中的猪链球菌2型通常要经过增菌培养来提高检测结果的准确性。该试验模拟直接从猪肝样本中提取细菌基因组DNA，当样品中猪链球菌2型数量达到12 CFU/g时，就可以采用该方法被检测出。该试验结果表明在人工布菌猪肝样本中，溶菌酶-苯酚法在试验中检测出的猪链球菌2型含量较高。猪肝样品中，受到猪肝基质的影响，可能是柱式纯化试剂盒法的过滤管效果受到猪肝基质的影响而发生堵塞，影响了基因组的吸附与洗脱。然而，纯培养细菌由于不含其他有机杂质，采用试剂盒方法提取基因组DNA的效果较好。笔者建立的荧光定量猪链球菌2型检测方法具有很好的特异性与灵敏度，对纯培养的灵敏度最低可达12 CFU/g。该研究结果可为荧光定量qPCR检测猪链球菌2型应用中合理选择基因组DNA的提取方法提供参考。

参考文献

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