大孔吸附树脂法纯化红皮云杉多酚工艺研究

周芳 赵鑫 张琪斐 王振宇

摘要[目的]获得大孔吸附树脂法纯化红皮云杉多酚的最佳工艺条件。[方法]通过静态试验筛选大孔吸附树脂，然后再进行动态试验，通过单因素和正交试验，得到纯化红皮云杉多酚的最佳工艺条件。[结果]以D101为固定相介质，红皮云杉多酚的最佳纯化工艺条件为上样浓度1.5 mg/mL、上样量25 mL、径长比1∶25、洗脱剂浓度70%、洗脱流速2.0 mL/min，多酚得率为56.88%。[结论]该研究为红皮云杉的开发利用提供了理论依据。

关键词 红皮云杉多酚；大孔吸附树脂；纯化；最佳工艺

中图分类号 S789 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-147-03

Abstract[Objective]To obtain the optimal purification conditions of polyphenol from Picea koraiensis Nakai by macroporous adsorption resin.[Method]Macroporous adsorption resin was screened by static experiment. Dynamic experiment was carried out. Single factor and orthogonal tests obtained the optimal technology of purified polyphenol from P. koraiensis.[Result]With D101 as stationary phase medium， the optimal purification technology was as follows： 1.5 mg/mL sample concentration， 25 mL sample volume， 1∶25 diameterlength ratio， 70% eluent concentration， and 2.0 mL/min elution velocity. The extraction rate of polyphenol was 56.88%.[Conclusion]This research provides theoretical foundation for the development and utilization of P. koraiensis.

Key words Polyphenol from Picea koraiensis Nakai； Macroporous adsorption resin； Purification； Optimal purification

植物多酚是多羟基酚类化合物的总称，又叫单宁、鞣质，广泛存在于植物体的叶、皮、壳和果肉中，具有抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[1-2]。红皮云杉（Picea koraiensis Nakai）是松科云杉属常绿乔木，分布于大、小兴安岭、完达山、张广才岭、吉林长白山等地。研究表明，松科植物的球果、树皮及种子壳中含有大量的多酚类化合物[3]。前人对植物多酚的提取和纯化工艺的研究较多[4-10]，如董文斌等[4]研究了杜仲葉多酚的提取分离工艺、熊何健等[6]采用大孔吸附树脂法研究了葡萄多酚的纯化工艺。但有关红皮云杉多酚的提取和纯化工艺研究较少，为此，笔者采用静态吸附试验法对5种大孔吸附树脂进行筛选，再以最佳大孔吸附树脂作为固定相介质进行动态试验，通过单因素和正交试验，得到纯化红皮云杉多酚的最佳工艺条件，为红皮云杉多酚的进一步深入研究和开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料

红皮云杉球果（长白山）。

1.2 试剂与仪器

无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、D101大孔吸附树脂、AB8大孔吸附树脂、X5大孔吸附树脂、NKA2大孔吸附树脂、ADS7大孔吸附树脂、Folin酚试剂、NaCl；FW100型高速万能粉碎机、ALC1104电子天平、RE52A旋转蒸发器、超声波萃取仪、TDL5W台式低速离心机。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理。将干燥的红皮云杉球果粉碎，过40目筛，用石油醚浸泡24 h去除油脂，再烘干备用。以40%乙醇作溶剂，在料液比为1∶35、温度为60 ℃、功率为300 W的条件下，将红皮云杉粉末用超声波萃取仪处理2.5 h，再将提取液离心10 min，转速为4 000 r/min，取上清液即为红皮云杉多酚粗提液，采用福林酚法测定多酚含量[3]。

1.3.2 大孔吸附树脂的选择。

称取大孔吸附树脂NKA2、 D101、AB8、X5、ADS7各10.0 g，分别加入50 mL浓度为1 mg/mL的红皮云杉多酚粗提液，室温条件下振荡4 h，每0.5 h取样1.0 mL测定多酚含量，根据公式（1）计算吸附率；再用60%乙醇溶液在室温条件下振荡4 h，每0.5 h取样1.0 mL上清液测定多酚含量，根据公式（2）计算解吸率。

1.3.3 单因素试验。

1.3.3.1 上样量对洗脱效果的影响。

在洗脱剂为60%乙醇、洗脱流速为1.5 mL/min、径高比为1∶25、上样浓度为1.5 mg/mL，上样量分别为15、20、25、30、35、40 mL的条件下，测定洗脱液的吸光度值，计算红皮云杉多酚得率。

1.3.3.2 洗脱剂浓度对洗脱效果的影响。

在洗脱流速为1.5 mL/min、径高比为1∶25、上样量为25 mL，洗脱剂分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇的条件下，测定洗脱液的吸光度值，计算红皮云杉多酚得率。

1.3.3.3 洗脱流速对洗脱效果的影响。

在洗脱剂为60%乙醇、径高比为1∶25、上样量为25 mL，洗脱流速分别为0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的条件下，测定洗脱液的吸光度值，计算红皮云杉多酚得率。

1.3.3.4 径长比对洗脱效果的影响。

在洗脱剂为60%乙醇、洗脱流速为1.5 mL/min、上样量为25 mL，径高比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的条件下，测定洗脱液的吸光度值，计算红皮云杉多酚得率。

1.3.4 正交试验。

在单因素试验的基础上，选择径长比、洗脱剂浓度、洗脱流速3个因素设计L9（33）的正交试验（表1），优化红皮云杉多酚的纯化工艺条件。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂的选择

由图1可知，5种大孔吸附树脂中ADS7的吸附率和解吸率最低，AB8、X5和D101的吸附率和解吸率均较高，其中AB8和D101的效果好于X5，且二者的效果比较接近，但D101更好，因此该试验选用D101对红皮云杉多酚进行纯化。

2.2 单因素试验

2.2.1 上样量对洗脱效果的影响。由图2可知，在上样量为15～25 mL，随着上样量的增加，多酚得率呈现上升趋势，且有明显的线性关系；在上样量为25～40 mL，随着上样量的增加，多酚得率反而明显下降，说明上样量过多，可能使大孔吸附树脂处于过饱和状态，且多酚损失也随之增加。因此，选择25 mL为最佳上样量。

2.2.2 洗脱剂浓度对洗脱效果的影响。由图3可知，洗脱剂浓度在40%～60%，多酚得率明显增加，且呈现出明显的线性关系；洗脱剂浓度在60%～70%，多酚得率增加趋势缓慢，在70%时多酚得率最高；洗脱剂浓度在70%～90%，多酚得率有所下降，说明乙醇浓度过高，极性下降较多，不能有效地溶解具有极性的多酚。因此，选择70%为最佳洗脱剂浓度。

2.2.3 洗脱流速对洗脱效果的影响。由图4可知，洗脱流速在0.5～1.5 mL/min，多酚得率明显增加，且有一定的线性关系；洗脱流速在1.5～2.0 mL/min，多酚得率增加缓慢，在2.0 mL/min处多酚得率最高；洗脱流速在2.0～3.0 mL/min，多酚得率有所下降，说明洗脱流速过快不利于多酚从大孔吸附树脂中解吸出来。因此，选择2.0 mL/min为最佳洗脱流速。

2.2.4 径长比对洗脱效果的影响。由图5可知，径长比在1∶15～1∶25，多酚得率明显增加，且有一定的线性关系，径长比为1∶25时，多酚得率最高；径长比在1∶25～1∶40，多酚得率明显下降。因此，选择1∶25为最佳径长比。

2.3 正交试验

从表2可看出，各因素对洗脱效果影响的主次顺序为洗脱流速>径长比>洗脱剂浓度，多酚得率最高的组合为A2B1C2；根据极差分析，最佳组合为A2B2C2。因此，在A2B2C2条件下，进行3次平行验证试验，红皮云杉多酚得率结果分别为56.48%、56.82%、57.35%，平均得率为56.88%，高于A2B1C2的得率。因此，选择A2B2C2为纯化红皮云杉多酚的最佳工艺条件，即径长比为1∶25、洗脱剂浓度为70%、洗脱流速为2.0 mL/min。

3 结论

该试验采用大孔吸附树脂法纯化红皮云杉多酚，通过静态试验从5种大孔吸附树脂中筛选出效果最好的D101；再以D101为固定相介质进行动态试验，通过单因素和正交试验，得到了纯化红皮云杉多酚的最佳工艺条件：上样浓度1.5 mg/mL、上样量25 mL、径长比1∶25、洗脱剂浓度70%、洗脱流速2.0 mL/min，在此最佳条件下多酚得率为56.88%。

参考文献

[1]赵扬帆，郑宝东.植物多酚类物质及其功能学研究进展[J].福建轻纺，2006（11）：107-110.

[2]苏晓雨，王振宇.红松子种皮提取物活性成分及抗氧化作用研究[J].林产化学与工业，2010，30（4）：99-102.

[3]周芳，赵鑫，宫婕，等.响应面法优化超声辅助提取红皮云杉多酚工艺[J].食品工业科技，2014，35（1）：210-213.

[4]董文斌，许仙猛.杜仲叶多酚的提取及分离工艺研究[J].陕西科技大学学报（自然科学版），2011，29（1）：60-65.

[5]苏晓雨，王振宇.红松种子壳多酚物質的提取及抗氧化特性[J].农业工程学报，2009，25（1）：198-203.

[6]熊何健，吴国宏.大孔吸附树脂分离纯化葡萄多酚的研究[J].食品研究与开发，2007，28（11）：74-77.

[7]赵艳红，李建科，李国荣，等.石榴皮多酚纯化及其抗氧化活性表征[J].食品科学，2011，31（ 11）：31-37.

[8]王振宇，刘春平.大孔树脂AB-8对苹果多酚的分离纯化[J].食品研究与开发，2009，30（ 4）：21-24.

[9]崔泰花，沙迪，申玉，等.桔梗茎叶多酚提取工艺的优化[J].延边大学农学学报，2015（3）：221-226.

[10]王有琼，马李一，张重权，等.印楝树皮多酚的提取工艺研究[J].西南农业学报，2016（3）：552-557.