3种消毒剂对金黄色葡萄球菌杀菌作用的研究

苏润雨，聂伯尧，杨百亮



3种消毒剂对金黄色葡萄球菌杀菌作用的研究

苏润雨，聂伯尧，杨百亮通信作者

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384）

为了解来苏儿、百毒杀、84消毒液对金黄色葡萄球菌的抑制作用，本试验通过采集脓汁并分离鉴定出金黄色葡萄球菌，采用抑菌试验和悬液定量杀灭试验对来苏儿、百毒杀、84消毒液杀灭金黄色葡萄球菌的效果进行观察。结果显示：84消毒液和百毒杀作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径明显大于来苏儿，且5～20 min内能快速高效杀灭金黄色葡萄球菌，来苏儿的杀灭率较低。来苏儿对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，百毒杀和84消毒液对金黄色葡萄球菌有很好的杀灭作用，84消毒液优于百毒杀。

消毒剂；金黄色葡萄球菌；杀灭作用

金黄色葡萄球菌（）简称金黄色葡萄球菌，为革兰氏阳性无芽孢球菌，广泛分布于空气、水、土壤、饲料、人和动物体表及与外界相通的腔道，常引起人和动物组织器官脓肿、创伤化脓以致败血症、脓毒败血症以及食物中毒等，也可引起葡萄球菌病，其临床表现为消瘦、精神沉郁，伴有腹泻，一年四季均可发生，尤以气候温暖和潮湿季节多发，属于人兽共患病原菌[1]。金黄色葡萄球菌引起的皮肤化脓感染和手术部位的化脓性感染目前在宠物行业越来越多见，因此采用有效的消毒剂来对病原体进行消灭，对其传播途径进行切断，控制疾病的蔓延，保护易感种群显得十分必要。

近年来，消毒剂在细菌污染方面的广泛应用得到了高度重视，但消毒剂的种类多，作用原理大不相同，来苏儿是含50%煤酚的肥皂溶液，又称为煤酚皂，其主要杀菌成分为甲酚，属于酚类消毒剂，其消毒原理是使蛋白质变性、沉淀，使酶系统失活，能抑制和杀死部分细菌的繁殖体和亲酯病毒，属于低效消毒剂[2]。百毒杀属双链季铵盐类消毒剂，其主要成分为10%葵甲溴铵溶液，主要是通过改变细胞膜的通透性，使细胞质外漏进而杀灭细菌等微生物[3]。84消毒剂属卤素类消毒剂，其杀菌机理是氧化菌体中的活性基团，与氨基结合使蛋白质变性。选择细菌敏感性高的消毒剂在防控动物疫病方面至关重要。

本试验通过杯碟法和悬液定量杀灭法研究来苏儿、百毒杀、84消毒剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用，选用合适的消毒剂来快速消灭金黄色葡萄球菌，以较好地控制化脓性感染和葡萄球菌病。

1 材料

1.1 病料

本试验无菌采取天津农学院附属动物医院一患脓皮病白色泰迪幼犬背部化脓处的脓汁，置 4 ℃冰箱待检。

1.2 消毒剂与中和剂

来苏儿、百毒杀、84消毒液分别配制5种浓度：2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%，并做好标记，硫代硫酸钠中和剂、吐温-80中和剂[4]均由天津农学院预防兽医学实验室提供。

1.3 试验器材与试剂

超净工作台、恒温恒湿培养箱、高压灭菌锅、恒温培养振荡器、电子天平、电子显微镜，冰箱、电炉子、牛津杯、游标卡尺及常用玻璃器材由天津农学院预防兽医学实验室提供；营养琼脂粉、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏、蒸馏水、3%过氧化氢溶液等由天津农学院预防兽医学实验室提供；葡萄球菌属细菌生化鉴定管购于杭州天和微生物试剂有限公司；羊血琼脂培养基购于天津金章科技公司。

2 方法

2.1 培养基的制备

营养琼脂培养基制备：营养琼脂 42 g，加入 1 000 mL纯化水加热煮沸溶解，并高压灭菌备用。倒板时需在超净工作台中进行。

7.5%氯化钠肉汤制备：蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，氯化钠75 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.4，加热溶解，调节pH值，分装，121 ℃高压灭菌15 min[5]。

普通液体培养基制备：牛肉膏3～5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，加热溶解，调节pH7.4～7.6，过滤分装，121 ℃高压灭菌15 min。

2.2 细菌的分离培养与纯化

无菌采取脓汁，并与生理盐水按1:10比例混合，接种于7.5%氯化钠肉汤中并放在37 ℃恒温箱进行增菌培养18～24 h[6]，取出并观察细菌的生长状况。然后划线接种于营养琼脂和羊血琼脂培养基上，倒置37 ℃恒温箱中培养18～24 h，取出并观察细菌的菌落特征。然后挑取可疑单个菌落于羊血琼脂上进行纯化培养，并观察菌落特征，放置4 ℃冰箱备用。

2.3 镜检

用灭菌接种环挑取有溶血现象的单个菌落于洁净的载玻片上，并与少量适当生理盐水混匀，均匀地涂布成适当大小的薄层[7]。待自然干燥后将其固定，然后做革兰染色，在显微镜下镜检观察细菌的形态。

2.4 菌悬液的制备

将分离出的单个菌落接种到普通液体培养基中，放到37 ℃恒温培养振荡器中培养24 h，观察培养基的浑浊度，根据其浑浊度再培养12 h，制备成均匀的菌悬液[8]。然后拿出培养基置于4 ℃冰箱备用。

2.5 触酶试验

取洁净载玻片1张，用接种环挑取单个菌落于载玻片上，然后滴加一滴3%H2O2，立即观察结果[9]。

2.6 生化试验

将细菌纯化后，取典型的单个菌落分别接种于乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、木胶糖、尿素、蕈糖、N-乙酰葡糖胺、硝酸盐生化管，37 ℃培养24 h[10]。

2.7 抑菌试验

采用杯碟法，取0.1 mL菌悬液于营养琼脂培养基上，涂布均匀，然后再轻轻的放5个无菌牛津杯，要求分散且等距[11]。在牛津杯中分别加入 5种浓度梯度且等量的消毒剂，做好标记。放入37 ℃恒温箱中培养24 h，取出，观察比较抑菌圈大小，测出并记录各抑菌圈的直径[12]。该试验重复3次，取平均值。

2.8 悬液定量杀灭试验

该工艺能够将油层近井地带的散砂、污染物和杂质排出地面，解决了出砂油藏油井生产管理中存在的砂埋油层、井筒砂堵、井下及地面设备磨蚀、砂卡等突出矛盾，简化了出砂油田的采油工艺，延长了油井生产周期，降低了油井的维护费用；同时利用加温后的地层水作动力液，循环过程中提高了地层温度，对稠油起到降黏功效的同时增加了近井地带油层渗透率，从而大幅度提高了油井的产能。

首先，10倍倍比稀释菌悬液并涂板计数，作为消毒前菌数。然后取菌悬液50 μL分别加入450 μL不同浓度的消毒剂，混匀，分别作用5 min及20 min后，取出100 μL加到900 μL中和剂中（84消毒液的中和剂为硫代硫酸钠，来苏、百毒杀的中和剂为吐温-80），此时溶液共1 000 μL，再从这1 000 μL中取50 μL混合液加入450 μL灭菌蒸馏水，取样液并稀释涂板，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，进行活菌计数，作为消毒后菌数，并计算杀灭率[13]。

3 结果

3.1 菌落形态与形态学检查

营养琼脂培养基上生长良好，形成湿润、表面光滑、边缘整齐、不透明、隆起的金黄色圆形菌落（图1A）；羊血琼脂培养基上形成的菌落较大，菌落周围出现溶血环（图1B）。细菌在普通液体培养基和7.5%氯化钠肉汤中37 ℃培养24 h后，均匀浑浊，管底有少量沉淀，摇动易散；在油镜下，可见革兰氏染色为阳性，成对、短链或成串（葡萄状）排列，无芽孢荚膜。由此可初步判断其为金黄色葡萄球菌。

（注：A. 普通培养基上生长的菌落；B. 羊血琼脂培养基上生长的菌落）

3.2 触酶试验结果

大多数需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科为阴性。本试验过程中产生大量气泡，为阳性结果，可进一步确定此菌为金黄色葡萄球菌。

3.3 生化试验结果

细菌生化鉴定结果见表1。该菌能分解乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、尿素等物质，产酸不产气，硝酸盐还原为亚硝酸盐，与葡萄球菌生化特性相符。

表1 生化试验结果

注：＋表示呈阳性

3.4 抑菌试验结果

由图2和表2可知，百毒杀和84消毒液对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用，经杯碟法试验可见，两种消毒剂在5个浓度梯度上均有明显的抑菌圈，且84消毒液的抑制作用较强。2.0%以上浓度的来苏儿对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用，1.5%以下浓度的来苏儿对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，0.5%浓度的来苏儿对金黄色葡萄球菌几乎没有抑制作用。相同条件下，金黄色葡萄球菌对3种消毒剂的敏感性均随浓度的升高而升高。

（注：A. 来苏儿处理组；B. 百毒杀处理组；C. 84消毒液处理组）

表2 不同浓度的消毒剂抑菌圈直径大小 cm

3.5 悬液定量杀灭试验结果

如表3所示，各浓度84消毒液与金黄色葡萄球菌作用5 min对其杀灭率即为100%；各浓度百毒杀与金黄色葡萄球菌作用20 min对其杀灭率为100%，但作用5 min时，1.5%以上浓度的百毒杀对其杀灭率才达到100%，可见84消毒液对金黄色葡萄球菌的杀灭效果优于百毒杀。来苏儿对金黄色葡萄球菌的杀灭作用较弱，2.0%以下浓度的来苏儿对金黄色葡萄球菌的杀灭率均较低，2.5%浓度的来苏儿对金黄色葡萄球菌有一定杀灭作用。综上所述，在相同的时间下，随着浓度的增加，各种消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭作用均逐步增强，84消毒液的杀灭作用最好，其次为百毒杀，来苏儿的杀灭作用最弱。

表3 消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭率

4 讨论

4.1 分离鉴定

本次试验分离菌在羊血琼脂培养基上生长的菌落较大，且有完全溶血现象，这与金黄色葡萄球菌的菌落生长特征相同。普通培养基上形成湿润、表面光滑、边缘整齐、不透明、隆起的圆形菌落与金黄色葡萄球菌的生长特性相符。镜检结果可知，菌体堆积成葡萄串状排列、无芽孢、无荚膜的革兰氏阳性菌落，结合以上结果可初步确定此菌为葡萄球菌。生化试验结果全为阳性，进一步说明此菌为金黄色葡萄球菌。因金黄色葡萄球菌与链球菌的生长特性及显微镜下细菌的形态相似，不好区分，但链球菌不具有过氧化氢酶，所以采用触酶试验，其结果显示为阳性，即该菌具有过氧化氢酶活性，可立即分解过氧化氢，产生气泡，因此进一步确定此菌为金黄色葡萄球菌。

4.2 杀灭效果比较

本文通过杯碟法抑菌试验和悬液定量杀灭试验，比较研究了实验室常用的3种消毒剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。结果显示，时间、温度、消毒剂浓度相同的条件下，84消毒液和百毒杀作用的金黄色葡萄球菌抑菌圈直径明显大于来苏儿处理组的抑菌圈直径，说明来苏儿的抑菌作用最弱。温度、时间、消毒剂浓度相同的条件下，84消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭率高于百毒杀和来苏儿，来苏儿的杀灭率最低，与上述抑菌试验的结果吻合。综上所述，在相同试验条件下，84消毒液、百毒杀、来苏儿对金黄色葡萄球菌的杀灭效果依次降低，表明金黄色葡萄球菌对84消毒液、百毒杀的敏感性较高。其中百毒杀为季铵盐类消毒剂，有研究认为复合季铵盐类消毒剂对革兰氏阳性的敏感性较高，与本试验结论一致[9]。另外，3种消毒剂的杀菌效果均随作用时间的延长 而增强，与作用浓度也成正相关，这与其他相关的研究报道结果也类似[8]。

此外，由于目前抗生素滥用现象严重，一些常见病原菌的耐药性不断提高，给临床应用带来了严峻挑战。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是最常见的多重耐药菌，国内外屡有暴发流行的报道，已成为世界范围内医疗费用快速增长和导致患者死亡率升高的主要因素，成为当前医院感染控制的难点[14]。有研究报道显示，来苏儿对金黄色葡萄球菌临床菌株的抑菌作用明显弱于对标准菌株的抑制效果[11]。因此，本研究建议将这两种消毒剂交替使用，以避免金黄色葡萄球菌对其产生耐药性，造成巨大经济损失。

5 结论

试验表明，84消毒剂和百毒杀对金黄色葡萄球菌有很强的抑菌效果，来苏儿的抑菌效果相对较差，84消毒剂和百毒杀作为杀灭金黄色葡萄球菌的高效消毒剂，建议临床使用。

参考文献：

[1] 李毅. 金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展[J]. 中国卫生检验杂志，2004，14（4）：392-395.

[2] 王华，魏春华，周孝琼. 兔金黄色葡萄球菌的分离鉴 定[J]. 中国畜牧兽医，2004，14（4）：176-177.

[3] 戈胜强，柴同杰，秦梅. 奶牛乳房炎葡萄球菌的分离鉴定及耐药性检测[J]. 西北农林科技大学学报，2008，36（11）：40-45.

[4] 廖骏，叶庆临，王莉，等. 几种消毒剂的中和剂选择试验[J]. 医学动物防制，2001，17（7）：256-267.

[5] 韩文瑜，何昭阳，刘玉斌. 病原细菌检验技术[M]. 长春：吉林科学技术出版社，1992.

[6] 吴美云，敖日格乐，王纯洁，等. 牛粪中致病性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药物试验[J]. 江苏农业科学，2009（3）：249-250.

[7] 葛忆琳，朱仁义，陈越火. 临床分离的金黄色葡萄球菌对消毒剂抗力及其抗药基因研究[J]. 中国消毒学杂志，2010，27（6）：658-662.

[8] 高文凤，曹冉冉，刘衡川. 3种消毒剂对金黄色葡萄球菌杀灭效果的比较[J]. 现代预防医学，2012，39（4）：977-981.

[9] 张利平，姜晓峰. 复合季铵盐消毒剂对金黄色葡萄球菌的杀灭效果观察[J]. 中国消毒学杂志，2013，30（1）：21-22.

[10] 余克花，杨莉娜，傅颖媛，等. 聚维酮碘、戊二醛、氯氧三嗪泡腾片对金黄色葡萄球菌的杀灭作用[J]. 中华医院感染学杂志，2010，20（16）：2443-2444.

[11] 谢立新，张永红，金世香，等. 四种消毒剂对金黄色葡萄球菌杀菌效果的研究[J]. 河北医科大学学报，2004，25（4）：241-242.

[12] 王继. 四种消毒剂对六种病源微生物的杀灭试验[D]. 成都：四川农业大学，2012.

[13] 陈燕飞. 不同消毒剂对细菌的抑制作用[J]. 食品工程，2012（2）：28-30.

[14] 张友平，王凯，徐敏丽，等. 医务人员手耐甲氧西林金黄色葡萄球菌带菌状况及消毒效果的研究[J]. 护理学报，2011，18（12B）：65-67.

Study on Killing Effect of Three Disinfectants against

SU Run-yu, NIE Bo-yao, YANG Bai-liangCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To study the effects of Lysol, didecyl dimethyl ammonium bromide solution and 84 disinfectant in killing. Bacteriostatic test and suspension quantitative killing test were conducted in the laboratory, respectively. Larger inhibition zone were observed onagar media which were treated with 84 disinfectant and didecyl dimethyl ammonium bromide solution, andcould be killed by them quickly and effectively in 5~20 min. It is suggested that the sterile efficacy of Lysol is weaker significantly than other two disinfectants onAmong of these disinfectants, 84 disinfectant is the best choice in killing pathogenic bacteria clinically.

disinfectants;; killing effect

P641.131；S152.72

A

1008-5394（2016）03-0051-04

2016-01-05

天津市自然科学基金项目“猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体免疫生物制剂研制”（033608511）

苏润雨（1990-），女，河北唐山人，硕士在读，研究方向为预防兽医学。E-mail：1558761240@qq.com。

杨百亮（1960-），男，山西洪洞人，教授，硕士，主要从事预防兽医学研究。E-mail：bailiangyang@163.com。