云南汉族人群CD80基因多态性位点与肺癌的相关性*

李传印， 李盈甫， 史　荔， 马千里， 王云飞， 蔡秋龙， 洪　超， 俞建昆， 张新文， 姚宇峰

(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 云南 昆明　650118； 2.昆明医科大学第一附属医院 干疗科， 云南 昆明　650032； 3.昆明医科大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明　650118)



云南汉族人群CD80基因多态性位点与肺癌的相关性*

李传印1， 李盈甫2， 史荔1， 马千里3， 王云飞1， 蔡秋龙1， 洪超1， 俞建昆1， 张新文1， 姚宇峰**

(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 云南 昆明650118； 2.昆明医科大学第一附属医院 干疗科， 云南 昆明650032； 3.昆明医科大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明650118)

目的： 探讨云南汉族人群中CD80基因中的多态性位点(SNPs)rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)及rs41271393(C>T)与肺癌的相关性。方法： 选取云南地区汉族人群肺癌患者288例(病例组)，健康体检人群288例(对照组)，采用TaqMan探针基因分型方法对CD80基因中上述4个SNPs位点进行基因分型，研究其等位基因、基因型及所构建的单倍型在两组人群中的分布差异。结果： rs16829980(A>G)等位基因A和G、rs41271391(G>T)等位基因G和T、rs41271393(C>T)等位基因C和T在病例组和对照组中的分布频率的差异具有统计学意义(P=0.018, 0.015, 0.015)，单倍型分析结果显示GGTT单倍型是云南汉族人群肺癌发生的保护性因素(OR=0.723; 95%CI: 0.555～0.941)。结论： CD80基因SNPs位点rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C可能是云南汉族人群肺癌发生的危险因素，GGTT单倍型可能是云南汉族人群肺癌发生的保护性因素。

肺肿瘤； CD80基因； 单核苷酸多态性； 相关性； 汉族； 云南

肺癌是威胁人类健康的发病率最高的癌症，全世界每年约有160万死亡病例(占所有肿瘤死亡人数的19.4%)，而在中国肺癌新发病例和死亡人数约为70万和60万[1]。研究表明吸烟人群中患肺癌的风险是不吸烟者的20倍，这说明吸烟是肺癌发生的重要危险因素之一，但并非唯一诱因[2]。近年来研究发现宿主遗传因素在肺癌发生过程中也发挥重要作用，尤其是参与免疫识别和抗原提呈等基因中存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在肺癌发生发展过程中有显著影响[3-5]。CD80(又被称作B7-1)属于免疫球蛋白超家族成员，表达于抗原提呈细胞(APC)表面，为T细胞的活化提供重要的共刺激信号。肿瘤细胞表面CD80通常表达缺失，这对于肿瘤细胞的免疫逃逸机制非常重要。个体间CD80表达与否以及表达水平差异可能会造成个体免疫应答效率的差异，这可能在疾病甚至肿瘤发生中发挥重要作用。基因中的SNPs可能会影响基因表达及功能，研究显示CD80基因中的SNPs与多种疾病或癌症相关[6-7]。本研究选取4个位于CD80基因启动子及5′-UTR区域的SNPs位点：rs16829980(A>G)、rs41271391(G>T)、rs41271393(C>T)和rs16829984(G>C)，研究这些SNPs位点在云南汉族人群肺癌患者和健康人群中的分布，以期为肺癌的诊断、治疗提供新的靶点及思路。

1　对象与方法

1.1对象

根据“知情同意”原则，随机选取2012年10月～2014年5月确诊为肺癌的患者288例为病例组，采用世界卫生组织(WHO 2004)肺癌组织类型划分标准进行病理分型，采用国际肺癌临床分期系统进行临床分期。排除标准：(1)术前接受放化疗等抗肿瘤治疗的病例，(2)患有其他恶性肿瘤，或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、肾病等疾病的患者，(3)资料不全者。对照组288人为2013年10月～2016年5月正常体检者。所有对象均为居住于云南地区彼此无血缘关系的汉族个体，年龄30～75岁。病例组平均(55.55±10.67)岁，男女性别比197/91，病理类型鳞癌101例，腺癌178例，鳞腺癌5例，其他4例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期92例，196例。对照组平均(54.01±10.12)岁，男女性别比192/96，两组被检者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2基因组DNA提取和基因分型检测

采集空腹静脉血5 mL，用EDTA 或肝素抗凝，使用全血基因组DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，购于QIAGEN公司，货号51106)提取DNA。并用超微量紫外可见分光光度计(ND-2000，美国ThermoScientific公司)检测DNA的浓度和纯度。采用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测SNPs位点的基因分型，TaqMan探针、引物和SNPs分型试剂(TaqMan Genotyping Master Mix)均购自美国ABI公司(http://www.appliedbiosystems.com)。罗氏LightCycler 480 实时荧光定量PCR 仪检测SNPs 位点，并对检测样本SNPs位点进行分型。PCR 反应体积为20 μL，反应条件为95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s、60 ℃退火1 min，共40 个循环，40 ℃ 5 min 长延伸。分型试验以水代替样本模板作为阴性对照。用罗氏LightCycler 480 基因分型软件(LCS480 1.5.1.62)进行结果分析和基因分型，分型完成后对部分TaqMan分型结果进行测序验证。

1.3统计学分析

使用Hardy-Weinberg平衡检验样品的代表性，t检验检测对照组和病例组年龄是否有差异，χ2检验检测病例组和对照组性别是否有差异，并检测病例组和对照组中CD80基因各SNPs 位点基因型和等位基因频率的差异。SHEsis软件程序[8]计算连锁不平衡，用D′表示，D′值为0时，连锁完全平衡；D′值为1 时，连锁完全不平衡；D′>0.8时，认为存在强连锁。根据连锁不平衡结果构建单倍型，并检测单倍型频率在病例组与对照组之间的差异[9]。多重比较时采用Bonferroni进行校正，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1样品的代表性

CD80基因启动子区个SNPs 位点rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)和rs41271393(C>T)的基因型在对照组和病例组中的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，说明本研究中的样本是具有群体代表性的随机样本。

2.24个CD80 SNPs位点与云南汉族人群肺癌的相关性

结果显示，与对照组比较，病例组rs16829980(A>G)等位基因A的分布频率升高，G的分布频率降低，差异有统计学意义(P=0.018)，等位基因A是云南汉族人群肺癌发生的危险因素(OR=1.373， 95%CI：1.056～1.784)；rs41271391(G>T)中等位基因G的分布频率升高，T的分布频率降低，差异有统计学意义(P=0.015)，该位点等位基因G是云南汉族人群是肺癌发生的危险因素(OR=1.38,95%CI：1.065～1.796)；rs41271393(C>T)的等位基因C的分布频率升高，T的分布频率降低，差异有统计学意义(P=0.015)，该位点等位基因C是云南汉族人群肺癌发生的危险因素(OR=1.385; 95%CI：1.065～1.801)。而rs16829984(G>C)等位基因和基因型在对照组和病例组中的分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　4个CD80 SNPs位点基因型和等位基因在病例组和对照组的分布

2.34个CD80 SNPs位点连锁不平衡

连锁不平衡分析结果显示，在病例组和对照组rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)和rs41271393(C>T)间存在连锁不平衡，且各位点间D′值均>0.8，各位点间存在强连锁。

2.44个CD80 SNPs位点单倍型的构建

根据连锁不平衡结果构建rs16829980(A>G)、rs16829984(G>C)、rs41271391(G>T)和rs41271393(C>T)的单倍型，并对频率>3%的单倍型的分布频率进行分析，结果显示经过P值校正后， GGTT单倍型在病例组和对照组的分布频率的差异具有统计学意义(P<0.05)，说明该单倍型是云南汉族人群肺癌发生的保护性因素(OR=0.723; 95%CI:0.555～0.941)，见表2。2.54个CD80 SNPs位点与肺癌临床分期的关系

对CD80基因中4个SNPs位点在肺癌Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的分布频率进行分析，结果显示CD80基因中的4个SNPs位点的基因型和等位基因在肺癌Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中的分布频率分别比较，结果显示各分布频率间的差异无统计学意义(P>0.05)，说明CD80基因的4个SNPs位点的基因型和等位基因型分布与云南汉族人群肺癌的严重程度无关，见表3。

表2　4个CD80 SNPs位点的单倍型在病例组和对照组中的分布

表3　CD80 4个SNPs位点基因型和等位基因在不同临床分期肺癌中的分布

2.64个CD80 SNPs与肺癌病理类型的关系

结果显示CD80基因中的4个SNPs位点的基因型和等位基因在鳞癌和腺癌患者中的分布频率差异无统计学意义(P>0.05)，表明CD80基因中4个SNPs位点可能与云南汉族人群肺癌的病理类型无关。见表4。

表4　4个CD80 SNPs位点基因型和等位基因在肺鳞癌和肺腺癌患者中的分布

3　讨论

肿瘤的发生发展与机体免疫系统紧密相关，肿瘤细胞表达肿瘤特异性的抗原，可被机体免疫系统识别并清除，因此肿瘤的发生发展过程需要肿瘤细胞免疫逃避或诱导免疫抑制[11-13]。T细胞免疫是机体对抗肿瘤免疫的重要组成部分，T细胞的活化不仅需要MHC分子将特异性抗原提呈给T细胞表面的受体(TCR)，还需要第二信号，即抗原提呈细胞表面的共刺激分子与其配体结合产生的共刺激信号[13-15]。 CD80与其配体产生的共刺激信号是T细胞活化最重要的共刺激信号之一，研究发现，大多数肿瘤细胞表面缺乏CD80等共刺激分子，而这使抗肿瘤免疫中的平衡偏向了肿瘤细胞的免疫逃逸[16]。而向肿瘤细胞转染CD80可以在一定程度上挽回这种平衡，抑制肿瘤的生长，这说明共刺激分子在抗肿瘤免疫应答中发挥重要的作用[17-18]。目前大量研究结果表明CD80基因中的某些SNPs与疾病存在相关性[6-7,19]。CD80分子在许多肿瘤细胞表面缺少表达，这可能是肿瘤的一种免疫逃逸机制。而位于CD80基因启动子区域的SNPs可能是导致CD80在肿瘤细胞表面缺少表达的因素。因此本研究选取位于CD80启动子及5′-UTR区域的4个SNPs位点，研究其在云南汉族人群肺癌患者与健康对照人群中的分布差异，以确定这些SNPs位点与云南汉族人群肺癌发生与发展的相关性。

本研究结果显示rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C可能是云南汉族人群肺癌发生的危险因素，这可能是由于这些等位基因不利于CD80基因的表达，从而能促进疾病发生，而rs16829984(G>C)等位基因可能对CD80表达没有显著影响，所以在疾病发生过程中也不发挥显著作用，但目前这些SNPs位点是否影响CD80基因的表达水平以及相关机理还不是很清楚，这也将是下一步的研究重点。Wagner等[21]及Teutsch等[7]发现rs16829980(A>G)与多发性硬化疾病和人群无关，而本研究中该位点等位基因在肺癌病例和健康对照中的分布频率的差异有统计学意义(P<0.05)，rs16829980(A>G)是云南汉族人群肺癌发生的危险因素，说明这种相关性具有疾病和人种的特异性。本研究还发现rs41271391(G>T)以及rs41271393(C>T)等位基因与云南汉族人群肺癌的发生具有相关性， 4个SNPs存在较强的连锁关系，选择样本分布频率>3%的单倍型进行分析， 结果显示GGTT单倍型在病例组和对照组中分布频率的差异有统计学意义(P<0.05)，该单倍型是云南汉族人群肺癌发生的保护性因素(OR=0.723，95%CI：0.555-0.941)。这与本研究中rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C可能是云南汉族人群肺癌发生的危险因素的结果相符。另外，本研究还分析了这4个位于CD80基因中的SNPs与云南汉族人群肺癌不同临床分期以及不同病理类型的关系，结果显示这些SNPs与云南汉族人群肺癌不同临床分期以及病理类型无关。

综上所述，本研究发现CD80基因启动子及5′-UTR区SNPs位点rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C是云南汉族人群肺癌发生的危险因素，GGTT单倍型是云南汉族人群肺癌发生的保护性因素，而本研究选取的SNPs位点位于CD80基因的启动子及5′-UTR区域，因此推测rs16829980(A>G)中等位基因A、rs41271391(G>T)中等位基因G以及rs41271393(C>T)的等位基因C以及单倍型GGTT有可能是通过影响CD80基因转录及翻译效率，从而影响CD80基因的转录与表达水平，进一步影响抗原提呈过程中共刺激信号的产生，最终造成个体对疾病易感性的差异。然而要最终阐明这些SNPs位点与肺癌相关性的机理，还需对其进行功能研究。

[1] Cheng TD, Cramb SM, Baade PD, et al. The international epidemiology of lung cancer: latest trends, disparities, and tumor characteristics [J]. Journal of Thoracic Oncology, 2016,DOI:10.1016/j.jtho.2016.05.021.

[2] Sasco AJ, Secretan MB, Straif K. Tobacco smoking and cancer: a brief review of recent epidemiological evidence [J]. Lung Cancer, 2004(Suppl.2):3-9.

[3] Li Y, Yao Y, Qian X, et al. The association of adiponectin gene promoter variations with non-small cell lung cancer in a Han Chinese population [J]. PloS One, 2015(5): e0127751.

[4] 周竞贤, 马千里, 郭晨,等. 云南汉族人群内质网氨肽酶2基因多态性与非小细胞肺癌遗传易感性的相关性[J]. 中华结核病杂志, 2014(12): 909-914.

[5] Li D, Li R, Zhang J, et al. Association between the LIG1 polymorphisms and lung Cancer risk: a meta-analysis of case-control studies [J]. Cell Biochemistry and Biophysics, 2015(2): 381-387.

[6] Liao WL, Chen RH, Lin HJ, et al. The association between polymorphisms of B7 molecules (CD80 and CD86) and Graves' ophthalmopathy in a Taiwanese population [J]. Ophthalmology, 2011(3): 553-557.

[7] Wu D, Tang R, Qi Q, et al. Five functional polymorphisms of B7/CD28 co-signaling molecules alter susceptibility to colorectal cancer [J]. Cellular Immunology, 2015(1): 41-48.

[8] Shi YY, He L. SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci [J]. Cell Research, 2005(2): 97-98.

[9] Li Z, Zhang Z, He Z, et al. A partition-ligation-combination-subdivision EM algorithm for haplotype inference with multiallelic markers: update of the SHEsis (http://analysis.bio-x.cn) [J]. Cell Research, 2009(4): 519-523.

[11]Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation [J]. Cell, 2011(5): 646-674.

[12]Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion [J]. Science, 2011(6024): 1565-1570.

[13]Chen L, Flies DB. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co-inhibition [J]. Nature Reviews Immunology, 2013(4): 227-242.

[14]Ceeraz S, Nowak EC, Noelle RJ. B7 family checkpoint regulators in immune regulation and disease [J]. Trends in Immunology, 2013(11): 556-563.

[15]Thauland TJ, Koguchi Y, Dustin ML. CD28-CD80 interactions control regulatory T cell motility and immunological synapse formation [J]. Journal of Immunology, 2014(12): 5894-5903.

[16]Tirapu I, Huarte E, Guiducci C, et al. Low surface expression of B7-1 (CD80) is an immunoescape mechanism of colon carcinoma [J]. Cancer Research, 2006(4): 2442-2450.

[17]Zhang Q, Wang HY, Wei F, et al. Cutaneous T cell lymphoma expresses immunosuppressive CD80 (B7-1) cell surface protein in a STAT5-dependent manner [J]. Journal of Immunology, 2014(6): 2913-2919.

[18]Mir MA, Agrewala JN. Signaling through CD80: an approach for treating lymphomas [J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets, 2008(8): 969-979.

[19]Wagner M, Sobczynski M, Karabon L, et al. Polymorphisms in CD28, CTLA-4, CD80 and CD86 genes may influence the risk of multiple sclerosis and its age of onset [J]. Journal of Neuroimmunology, 2015(288)：79-86.

(2016-05-15收稿，2016-08-18修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 刘华

The Association of SNPs in CD80 Gene with Lung Cancer in Yunnan Han Population

LI Chuanyin1, LI Yingfu2, SHI Li1, MA Qianli3, WANG Yunfei1, CAI Qiulong1, HONG Chao1, YU Jiankun1, ZHANG Xinwen1, YAO Yufeng1

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentonSevereInfectiousDisease,Kunming650118,Yunnan,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,Yunnan,China; 3.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To explore the association of four single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs16829980A>G, rs16829984G>C, rs41271391G>T and rs41271393C>T in CD80 gene with the lung cancer in a Yunnan Han population. Methods: A total 288 patients with lung cancer and 288 healthy individuals were recruited in this study, and the genotyping of the above-mentioned four SNPs was analyzed by Taqman assay. The distribution of alleles, genotypes and constructed haplotypes in the two groups was studied. Results: There were statistically significant differences in distribution of A and G of rs16829980 A>G, G and T of rs41271391G>T, C and T of rs41271393 C>T between the case group and control group (P=0.018, 0.015 and 0.015). The frequencies of haplotypes result showed that GGTT haplotypes was protective factors of lung cancer in Han population of Yunnan Province (OR=0.723; 95%CI: 0.555～0.941). Conclusion: The A allele of rs16829980 A>G (OR=1.373; 95%CI: 1.056～1.784), the G allele of rs41271391G>T (OR=1.382; 95%CI: 1.065～1.796) and the C allele of rs41271393C>T (OR=1.385; 95%CI: 1.065～1.801) may be risk factors of lung cancer.

lung cancer; CD80 gene; single nucleotide polymorphisms; association; Han population; Yunnan province

国家自然基金项目(31270030、81573206)； 协和青年基金(3332015149)； 云南省应用基础研究重点项目(2016FA034)； 云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(2013FB169)； 中国医学科学院病原生物学研究所基本科研业务费项目(2012IPB107)

E-mail:leoyyf@gmail.com

R734.2； RZ274

A

1000-2707(2016)09-1015-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.09.006

**

网络出版时间：2016-09-13网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160913.2240.030.html