二色补血草内生真菌发酵产物抑菌活性研究

杨林，华栋，姜仪，郝泷，司佳宁，刘晓风（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730050）



二色补血草内生真菌发酵产物抑菌活性研究

杨林，华栋，姜仪，郝泷，司佳宁，刘晓风
（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730050）

采用组织块分离法分离二色补血草内生真菌，PDA液体培养基发酵，发酵液固液分离，发酵液（水相）依次以乙酸乙酯、正丁醇萃取，菌丝体（固相）干燥后甲醇提取，分别得到发酵液乙酸乙酯、正丁醇萃取物以及菌丝体甲醇提取物；滤纸片法进行抗菌活性筛选。结果从二色补血草不同部位共分离得到32株内生真菌，其中根中15株，茎中11株，叶中6株；二色补血草内生真菌发酵产物对各指示菌均有有不同程度的抑制作用，10株内生真菌的不同部位对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用，占分离菌株总数的31.25%。其中BL404乙酸乙酯、BR408正丁醇部位分别对肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌最小抑制浓度达到0.313mg/mL。研究结果表明，二色补血草内生真菌具有较强的抑菌活性，对指示细菌的抑制范围较宽，有一定的研究开发价值。

二色补血草；内生真菌；抑菌活性

二色补血草（Limonium bicolor）系白花丹科（P1umbaginaceae）补血草属（Limonium Mill）的多年生草本植物，别名苍蝇花、绳子草。主产于陕西、甘肃、宁夏、江苏、河南等地，其性微温，昧甘，具补血益气，止血散瘀，活血调经，益脾健胃之功效［1］。本实验对二色补血草内生真菌进行了分离并对其代谢产物抑菌活性进行了初步研究，旨在筛选出能产生抑菌活性物质的内生真菌，为发酵生产抑菌活性物质及二色补血草资源的综合开发奠定基础。

1 、材料与方法

1.1 植物材料

二色补血草（Limonium bicolor），于2014年9月采集于甘肃陇西县，由兰州理工大学生命学院杨林老师副教授鉴定。

1.2 实验方法

1.2.1 内生菌的分离及纯化

取新鲜的二色补血草植株，表面清洗干净，在无菌条件下，进行如下表面消毒：75%酒精浸泡5min→无菌水冲洗3次→0.01%升汞浸泡30s→无菌水冲洗3次，晾干。将植物材料剪切成0.5cm×0.5cm大小的片段，接种于加有100U/mL青霉素钠和硫酸链霉素的PDA平板上，置28℃恒温培养箱内培养3 10d，待组织周围长出菌落后，采用菌丝尖端挑取法，根据菌落形态、颜色、长出时间的不同，及时挑取材料周围菌丝转接于新鲜培养基上进行培养，反复纯化后转于PDA斜面上，编号，4℃保存备用。同时将经表面消毒后而不做切割的材料在培养基上做组织印迹，作为对照以检验消毒效果［2-4］。

1.2.2 内生菌发酵液的制备

将纯化后的内生真菌接种到新鲜的PDA培养基上，28℃培养7d活化菌株，活化后的菌种接种于500mLPD培养基，28℃，160r/min恒温震荡培养7-10d。发酵结束后，发酵液进行抽滤，将菌液和菌丝体分开，菌液先用等体积的乙酸乙酯萃取3次，然后用等体积的正丁醇萃取3次，分别合并有机相，回收溶剂，得到乙酸乙酯和正丁醇部位；菌丝体干燥，破碎，30-50倍体积的甲醇回流提取，提取液回收溶剂得到菌体甲醇部位，提取物置4℃冰箱，备用。

1.2.4 发酵产物抑菌活性检测

滤纸片法测定各样品抑菌活性，以G+性菌金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌和G－性菌大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌为指示菌，以上五种指示菌经37℃培养24h，活化后用无菌水洗涤制成菌悬液，调节菌体浓度至106CFU/mL，吸取1mL均匀涂布于事先倒好的牛肉膏蛋白胨平板上；取直径为6mm的无菌滤纸片，在无菌条件下用镊子放置于上述带菌平板上，每皿3片，轻压使其与培养基表面接触，然后用微量移液器吸取备好的各测试样品溶液（以甲醇稀释至10mg/mL）15μL分别滴加于纸片上，以溶剂甲醇为阴性对照，以100U/mL的硫酸链霉素或青霉素钠为阳性对照，每个样品设三个平行。加样后于37℃培养24h，十字交叉法测定各样品抑菌圈的大小。

最小抑菌浓度（MIC）的测定：选择对样品溶解度好且无抑菌作用的甲醇作为溶媒，采用二倍稀释法将样品配制为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156mg/mL系列浓度溶液，用滤纸片法测定抑菌圈直径，以实验组中出现抑菌圈的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

2 、结果与分析

从二色补血草植株中共分离到内生真菌32株，其中根部15株（46.87%）、茎部11（34.38%）、叶部6株（18.75%）。从分离部位可以看出，分离的菌株数量根部最多，其次为茎部和叶部。

2.1 二色补血草内生菌发酵产物抑菌活性测定结果

抑菌实验结果表明，二色补血草内生真菌发酵产物对各指示菌均有有不同程度的抑制作用，其中对大肠杆菌有抑制作用的样品占总数的80.8%，对金黄色葡萄球菌有抑制作用的占71.21%，对肺炎链球菌抑制作用的占87.27%，对地衣芽孢杆菌有抑制的占82.42%，对绿脓杆菌有抑制作用的占75.15%。其中有10株菌的不同部位对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用，占分离菌株总数的31.25%；4株菌分别对4种或多种指示菌具有明显的抑制作用，占菌株总数的12.50%。根据抑菌活性筛选结果，对每组指示菌有最强的抑菌作用的菌株进行最小抑菌浓度的测定，结果见表1。3株菌的最小抑菌浓度达到0.156mg/mL，2株菌的最小抑菌浓度达到0.313mg/mL。从以上结果可以看出，二色补血草内生真菌具有较强的抑菌活性，对指示细菌的抑制范围较宽，对抑菌作用具有一定的选择性。

表1 二色补血草内生真菌发酵产物抑菌活性测定结果

3 、结论

抑菌试验结果表明，二色补血草内生真菌抗菌活性菌株数占分离菌株数的85.26%，高活性菌株数占分离菌株数的12.50%，且内生菌发酵产物各提取物溶液浓度为10mg/mL时，菌株乙酸乙酯萃取部位的抑菌效果明显高于甲醇部位及正丁醇部位。表明二色补血草内生菌发酵产物中存在着丰富的抗菌活性物质资源，这为二色补血草内生菌资源及发酵抑菌活性物质资源的开发利用奠定了基础。

［1］ 许毅宏，张继，哈飞，等.人工栽培二色补血草前景［J］.植物杂志，2004，1：12

［2］ 王永忠，肖亚中.植物内生菌及其代谢产物［J］.生物医学杂志，2004，21（4）：1-5

［3］ 王瑶瑶，韩烈保，曾会明.禾本科植物内生菌研究进展［J］.生物技术通报，2008，（ 3）：34-37

［4］ 程丽娟，薛泉宏.微生物学实验技术［M］.西安：世界图书出版公司，2000：104 105.