黄瓜‘中国龙’毛状根诱导体系的建立

林志豪 ，邓钰宏 ，赵 静

（1．华南农业大学农学院 广州 510642； 2.广东生态工程职业学院 广州 510520）

黄瓜（Cucumis sativus L.）别名胡瓜、青瓜，属于葫芦科黄瓜属草本植物，在国内外广泛种植，同时它也是重要的设施蔬菜主栽种类之一，在全球蔬菜供应中占有举足轻重的地位。受抗性基因资源匮乏的限制，传统黄瓜育种方法很难快速得到具有抗性的优良品种。黄瓜基因组测序的完成[1]，为黄瓜遗传育种提供了重要的基因资源库。要对此基因宝库进行挖掘、筛选重要的基因资源，黄瓜的遗传转化方法显得尤为重要。

发根农杆菌侵染植物后，通过所含Ri质粒的T-DNA在植物细胞基因组中整合并表达，获得转基因毛状根[2]。毛状根能在无激素的培养基上生长，合成Ri T-DNA的表达产物冠瘿碱，并能自发或人工诱导再生植株[3]。利用转基因毛状根对兴趣基因进行功能分析，可大大缩短以往依赖于根癌农杆菌进行遗传转化所要的时间，利于对兴趣基因的功能研究，挖掘出可利用的基因资源。目前，利用发根农杆菌进行基因的功能研究在许多植物上都有报道，如大豆[4]、番茄[5]、苜蓿[6]、高丽参[7]、西洋参[8]等。

利用发根农杆菌对黄瓜进行遗传转化始于1991年，McInnes等[9]用含Ri T-DNA的发根农杆菌侵染黄瓜子叶外植体，诱导出毛状根。随后发根农杆菌诱导黄瓜毛状根形成的遗传转化体系得到不断优化和完善。1997年，施和平等[10]研究了乙酰丁香酮对发根农杆菌遗传转化黄瓜的影响，发现用添加乙酰丁香酮活化培养的菌液感染黄瓜子叶外植体生根更快；次年，该研究团队用2种发根农杆菌菌株（R1000和R1601）侵染子叶外植体，成功获得毛状根，结果表明，含不同质粒的农杆菌诱导黄瓜子叶发生的毛状根的形态和种类不同[11]；2000年他们又对黄瓜毛状根形成过程中合适的外植体年龄和蔗糖浓度进行了研究，发现10 d苗龄的子叶外植体产生毛状根的能力最强，外植体毛状根诱导率为88.89%，随着外植体年龄的增强，发根率减弱，直到不发根；培养基中添加2%、3%或4%的蔗糖可以显著提高子叶外植体的毛状根诱导率[12]。冯斌等[13]用发根农杆菌A4对‘津研4号’黄瓜的子叶和下胚轴进行诱导，得到了再生植株，转化植株的GUS染色检测呈阳性，但毛状根的芽分化率较低，再生率为1.6%。

对于同一物种的不同基因型，其体细胞胚发生的难易程度和发生频率存在差别[14]，故不同基因型材料毛状根诱导的适宜方法会有差异。‘中国龙’是用于黄瓜全基因组测序的品种[1]，前期的初步试验发现，利用现有的黄瓜毛状根诱导方法[11，15]，‘中国龙’毛状根的诱导不稳定、诱导率低，甚至出现不能诱导的现象。同时，以往的黄瓜毛状根诱导体系中，大都是用 HgCl2为表面消毒剂[11，15]，考虑到 HgCl2的毒性，以及对环境的污染，探索其他合适的灭菌方法是非常有必要的，于是本文在以往建立起来的黄瓜毛状根诱导体系的基础上，从种子灭菌、共培养时间和菌液浓度3方面进行探索，建立一套适合于‘中国龙’的毛状根诱导体系，可为今后分析黄瓜基因功能、挖掘黄瓜优良基因提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 细菌菌株及培养

试验所用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株为K599，由澳大利亚昆士兰大学Peter Gresshoff教授惠赠。在侵染黄瓜子叶前，将活化好的农杆菌单菌落接种于YEP培养基中，28℃振荡暗培养16 h，待用。

1.2 植物材料

试验材料为黄瓜测序品种‘中国龙’，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄三文研究员惠赠。

1.3 试验所用培养基

共培养 MS 培养基[16]：KNO31 900 mg·L-1、NH4NO31 650 mg·L-1、MgSO4·7H2O 370 mg·L-1、CaCl2332 mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、H3BO36.2 mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg· L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、EDTA-Fe 0.036 71 mg·L-1、KH2PO4170 mg·L-1、肌醇 100 mg·L-1、甘氨酸 2 mg·L-1、盐酸硫酸素 0.1 mg·L-1、盐酸吡哆素 0.5 mg·L-1、烟酸 0.5 mg·L-1、蔗糖 3%、植物胶0.3%，pH 调至 5.5～5.8。

诱导培养基及继代培养基：在共培养MS平板培养基中加入羧苄青霉素，最终配置成含羧苄青霉素（500mg·L-1）的 MS 平板培养基。

1.4 种子灭菌方法

在超净工作台中，将挑选出的饱满种子用75%（φ，后同）乙醇消毒30 s，再用3个不同浓度的NaC-lO消毒液（浓度分别为1%、5%、10%）分别灭菌5、10、15、20 min，然后用无菌水漂洗4或5次，种植于已灭菌的垫有MS营养液润湿的棉花的生长瓶中。每个生长瓶播10粒种子，每处理设置12个重复。置于24℃暗培养2 d，然后移入光照培养室中培养8 d，温度为白天24℃，夜晚24℃，每天12 h光照。

1.5 不同菌液侵染浓度处理

挑取活化后的单克隆菌落，接种到5 mL YEP液体培养基中培养过夜，用MS液体培养基稀释菌液浓度至 OD600值分别为 0.4、0.6、0.8和 1.2，待用。

在超净工作台上，取萌发10 d的黄瓜无菌苗子叶，用灭过菌的手术刀在子叶叶柄边缘处将黄瓜子叶切成2个外植体。将手术刀浸入至活化过的、调好OD600值的菌液中，再将沾有发根农杆菌菌液的手术刀在黄瓜子叶表面轻轻地纵向和横向划若干刀口，每划几刀将手术刀放至菌液中浸泡，以保证伤口处都有菌液侵染到。然后使其伤口面朝下，接至准备好的、铺有滤纸的共培养MS平板培养基中（伤口面接触滤纸），在26℃、光照条件下培养2 d。将培养好的受感染的黄瓜子叶外植体，伤口面朝上（切面不与培养基接触），转入准备好的毛根诱导用MS平板培养基，在24℃、遮光条件下暗培养。时常观察根毛生长状况。

1.6 共培养处理时间处理

用活化好的菌液调至OD600为1.2左右来侵染黄瓜幼苗，将侵染后的外植体置于共培养培养基上，先在26℃、光照条件下分别共培养2 d、3 d，再转入准备好的毛根诱导用MS平板培养基上，在24℃、遮光条件下暗培养。观察不同共培养时间对黄瓜毛状根诱导的影响。

1.7 毛状根rolC基因的PCR扩增

利用Roger和Bendich的CTAB法[17]提取所获得毛状根的DNA，再利用文献报道rolC基因引物[8]，扩增毛状根中的rolC基因，上游引物rolC-F：ATGGCGGAATTTGACCTATG，下游引物 rolC-R：TTAGTTCCATCTGCCCATCC。

PCR扩增反应体积为 20 μL，其中包括 10 μL Taq DNA 聚合酶，0.6 μL 10 μmol·L-1PCR 引物，和约0.2 μg DNA。用PTC-100型PCR扩增仪进行扩增反应。PCR反应程序为：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环，72℃总延伸 10min，4℃保存备用。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌条件对于黄瓜‘中国龙’种子萌发的影响

摒弃对人畜有剧毒的灭菌剂升汞，试验采用75%的乙醇与不同浓度的次氯酸钠相结合的方法对‘中国龙’进行种子灭菌。结果表明，当次氯酸钠浓度低时，种子出现长菌的情况；提高次氯酸钠的浓度，可以减少种子长菌的情况，但会抑制种子的萌发。统计各处理条件下能正常萌发的无菌苗的比例，结果如图1所示，当次氯酸钠浓度为1%时，培养瓶中出现长菌情况，萌发率在73%到89%之间；而当次氯酸钠浓度提高到10%时，种子长菌的情况减少，但黄瓜种子可能由于受到伤害，萌发受到抑制，萌发率仅在78%到85%之间；当次氯酸钠浓度为5%，灭菌时间为5 min或10 min时，黄瓜种子的萌发率最高，均为96%。因此，先使用75%的乙醇处理种子30 s，再用5%的次氯酸钠灭菌5～10 min，是获取黄瓜‘中国龙’无菌幼苗的较好的灭菌方式。

图1 不同灭菌条件对黄瓜萌发的影响

2.2 不同菌液浓度对黄瓜‘中国龙’毛状根诱导的影响

菌液的OD600值反映了菌液的浓度，不同OD600值的菌液对于黄瓜毛状根诱导的影响差异显著。如表1可知，当OD600值小于0.8时，毛状根诱导率较低，在21.24%～57.69%之间。OD600值为1.2时，黄瓜毛状根诱导率大大提高，为70.83%。故本试验中，菌液的OD600值在1.2左右时，是适合侵染的菌液浓度。

表1 不同浓度菌液对黄瓜毛状根诱导的影响

2.3 不同共培养时间对于黄瓜‘中国龙’毛状根诱导的影响

共培养时间是用菌液侵染外植体后，让发根农杆菌在没有加抗生素的环境下与外植体共同生长的时间。研究发现共培养的过程利于菌液的侵染，共培养时间为2 d时，外植体容易长出毛状根，而受到农杆菌的污染较少，污染率仅为5.26%（表2）。但当共培养时间超过2 d，农杆菌的生长旺盛，后期难以抑制（图版-a～b），农杆菌的污染率达到了84.85%（表 2）。

表2 不同共培养时间对外植体农杆菌污染的影响

2.4 黄瓜‘中国龙’毛状根的诱导、生长状况及鉴定

以黄瓜‘中国龙’子叶为外植体，在上述优化条件下，可获得大量毛状根（图版-c～g）。

以T-DNA上的rolC基因为检测对象，随机选取7条从不同外植体上诱导出的毛状根来抽取DNA，进行PCR扩增。在诱导获得的毛状根中都扩增出期望大小的rolC基因片段，该片段与从发根农杆菌K599的Ri质粒DNA中扩增出的特异性片段大小相同，而非转化毛状根的DNA未扩增出任何DNA条带（图2），表明发根农杆菌上的Ri T-DNA已整合到黄瓜的毛状根基因组中，获得的毛状根为转基因根。

图2 毛状根rolC基因的电泳检测

3 讨论与结论

以往所建立黄瓜毛状根诱导体系中，大多采用升汞（HgCl2）进行种子消毒[10-12]。升汞具有杀菌力强，渗透性好的特点，但对人畜有剧毒，且升汞灭菌后，较难彻底地清除残留的汞。本试验利用乙醇和次氯酸钠相结合的方法，探索了用不同浓度次氯酸钠（1%、5%和 10%）分别灭菌 5、10、15、20 min，观察种子污染和萌发的情况。结果表明，低浓度的次氯酸钠无法彻底进行种子的表面消毒，种子出现长菌污染的情况；而高浓度的次氯酸钠则会伤害种子，导致种子萌发率降低。而在5%次氯酸钠中消毒5～10 min的效果较好，污染少且萌发率高。所以本试验最终采用75%的乙醇先处理种子30 s，再用5%的次氯酸钠灭菌5～10 min的种子消毒方法。

菌液浓度对诱导效果表现出一定的影响，过高或过低的菌液浓度都不利于毛状根的诱导。徐明芳等[19]在研究大苞栝楼毛状根诱导体系时，发现其毛状根的诱导率与菌液浓度在一定范围内呈线性上升关系，而随着菌液浓度的增大又呈现非线性下降关系，认为这是因为在一定菌液浓度范围内，菌细胞越多越能增加感染的位点，有更多的菌株的质粒能够整合在外植体的基因组中，菌液浓度过高后对外植体细胞有损伤，毛状根诱导率反而下降，菌液OD600值为0.7是大苞栝楼最适的发根农杆菌诱导转化浓度。同样，王丽等[20]在研究龙葵毛状根诱导条件时发现菌液OD600为0.6时，毛状根诱导效果较好，而高于0.6后诱导效率急剧降低。本试验中，分析了菌液OD600从0.2到1.2时，‘中国龙’的毛状根诱导率，发现菌液浓度过低起不到感染的目的，毛状根诱导率低，当OD600值在1.2左右时毛状根诱导率比较合适。

共培养是农杆菌侵染外植体后，在不含任何抗生素的条件下，让农杆菌和外植体共同生长的过程。研究发现共培时间的长短影响着毛状根诱导率，这是因为发根农杆菌的T-DNA与外植体整合需要一定的时间。共培养时间不够，则不能完成T-DNA的转移与整合，不能诱导毛状根，不利于农杆菌将发根基因诱导到外植体基因中，而共培养时间过长又会导致农杆菌大量繁殖，给以后的除菌带来困难，农杆菌除不净就会使外植体失活，直接影响诱导率。孙敏等[20]在研究共培养时间对发根农杆菌诱导长春花发根时发现，共培养2 d时的毛状根诱导率最高，达50.70%，从第3天开始，诱导率不断下降。同样，在龙葵上的研究结果也表明共培养2 d毛状根诱导率最高[21]。本试验结果表明黄瓜‘中国龙’在毛状根诱导过程中，如果共培养超过2 d，发根农杆菌会过度生长，对外植体生产毒害，难以诱导毛状根。

以黄瓜基因组测序品种‘中国龙’为材料，建立其毛状根诱导体系，可为充分利用该品种进行黄瓜的遗传改良、挖掘黄瓜基因资源提供技术支撑。（本文图版见彩插10）