研究剪应力生物效应时难以回避压力的联合效应*

郝杨阳　曹　军　殷小杰　贡磊磊　原会俊　王　岚　梁日欣,#　廖福龙，#



研究剪应力生物效应时难以回避压力的联合效应*

郝杨阳1曹军2殷小杰2贡磊磊2原会俊1王岚2梁日欣2,#廖福龙2，#

目的：生物力药理学研究常用流动小室或血管段观察剪应力的生物学效应；法向压力可能参与其中。本文探讨不同剪应力和压力对家兔离体血管内皮细胞环氧化酶-1(COX-1)mRNA和组织纤溶酶源激活物(t-PA)mRNA表达水平的影响。方法：手术分离实验家兔腹主动脉共15段，应用离体血管灌流装置，建立家兔动脉血管在不同剪应力(1.5-20dyn/cm2)和平均压力(<50 000dyn/cm2)条件下的加载模型；实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定不同剪应力及压力水平时实验兔动脉血管COX-1 mRNA、t-PA mRNA的表达水平及其相互关系。结果：(1)单独观察剪应力效应：剪应力在1.5-20dyn/cm2范围内，COX-1 mRNA和t-PA mRNA相对表达水平随着剪应力增加而升高，均呈显著正相关(P<0.01)，回归方程分别为y=0.0261x+0.0886和y=0.2033x+1.2082。(2)综合观察剪应力和压力的联合效应：剪应力(x)和压力(y)以复杂的非线性方式显著影响COX-1 mRNA和t-PA mRNA的表达，可采用二元二次方程进行定量描述，分别为COX-1 mRNA=0.3619-0.0389x+8.8645×10-7y+0.0015x2+1.515×10-6xy-3.1759×10-10y2(P<0.01)和t-PA mRNA = 2.9572-0.047x-6.5219×10-5y+0.01x2+2.2973×10-6xy+6.9716×10-10y2(P<0.01)。结论：生物力药理学研究剪应力的生物效应时，压力的影响不可避免，应综合分析剪应力与压力的联合作用，推荐采用二元二次方程进行有效描述。

剪应力；压力；生物学效应；生物力药理学；家兔

动脉血栓形成是严重危害人类健康的一种血管常见病，具有很高的致残率和致死率。血栓形成是一个动力学过程，与局部血流和血管壁状态密切相关，是血液、血流与血管相互作用的结果。血液在血管内流动，对血管内皮细胞产生了平行于血流方向的剪应力(即血流对血管内皮细胞的摩擦力)，以及垂直于血流方向的周应力(包括压力与牵张力)[1]。血液流变学研究认为，血液、血流与血管间的相互作用是通过血流剪应力实现的，调节剪应力对于维持血管内皮细胞稳态具有积极效应；从生物力药理学角度分析，血流剪应力等生物力作用可等效于药物，它通过影响多种内皮细胞功能因子的转录表达和分泌功能，调控血栓形成倾向与血栓溶解能力[2,3]。生物力药理学研究常用流动小室和血管段观察剪应力的生物学效应时，难以回避血流压力这一因素，即压力也可能参与了生物效应。但有关压力与剪应力的关系及如何描述两者对血栓因子作用的研究尚少。因此，本文通过建立离体血管不同剪应力及压力加载模型，检测分析不同剪应力和压力水平下离体血管内皮细胞环氧合酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1) mRNA和组织型纤溶酶原激活物(Tissue Type Plasminogen Activator Enzyme，t-PA)mRNA的表达及压力参与生物学效应的描述方法。

1　材料与方法

1.1实验动物

日本大耳白家兔15只，雌雄各半，体重2.1-2.5kg，购自北京芳元缘养殖场，动物许可证号SCXK(京)2014-0012，无明显临床疾患症状，适应性饲养一周后进行实验。

1.2主要试剂

5%胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批号 150131)，100U/ml青霉素、100U/ml链霉素(美国Thermo公司，批号 J130047)，营养液(美国Gibco公司，批号1646027)，Trizol、RNA clean Kit、FastQuant RT Kit(北京TIANGEN Biotech公司，批号依次为04120、03806、P4119)，KAPA SYBR FAST qPCR Kit(美国 KAPABIOSYSTEMS 公司，批号 KK4601)。

1.3主要仪器

压力传感器、MP150型多导生理仪(美国Biopac System公司)，恒温水浴箱(北京长风仪器仪表厂)，多功能蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)，低温高速离心机、台式离心机(德国sigma公司)，混合型碾磨仪(德国Retsch公司)，PCR扩增仪、荧光定量PCR 7300检测系统(美国Applied Biosystems公司)，凝胶成像系统(法国Vilber Lourmat公司)。

1.4离体血管灌流实验

1.4.1血管分离：15只家兔皆用20%乌拉坦溶液，按5ml/kg体重耳缘静脉注射麻醉，常规手术开腹，暴露腹主动脉并测量在体管径和长度，之后摘取每只家兔腹主动脉(共15段)，其中1段作为RT-PCR校准样本使用，其余14段用3.8%枸橼酸钠溶液冲洗干净后，进行离体血管灌流。

1.4.2体外血管不同剪应力及压力加载模型的建立：参照Veronica Gambillara等[5]和刘波等[6]的方法。离体血管灌流装置见图1，主要由血管培养腔、蠕动泵、压力传感器、多导生理记录仪以及硅胶管连接而成。实验时，血管培养腔置于恒温水浴箱中培养，环境温度保持37℃，培养液(PBS缓冲液)中加入二元混合气(5%CO2+95% 空气)以维持内皮细胞功能；通过蠕动泵调节灌流液(成分包括：5%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和营养液[5])流速，形成不同水平壁面剪应力(τ)作用于血管，其定量计算公式为τ= 4Qη/πr3(Q为灌流液流量，η为液体黏度，r为血管半径)，τ大小从1.88-18.71dyn/cm2，每例灌流时间100min；多导生理记录仪同时记录血管段两端压力(入口P1，出口P2)，并计算平均压力P=P2+(P1-P2)/2，其大小从5 129.67-44 134.45dyn/cm2。

图1　离体血管灌流装置示意图

1.4.3样品处理：灌流实验结束后，立即将动脉血管段用锡箔纸包裹并置于EP管，于液氮中冻存后置于-80℃冰箱保存备用。

1.5RT-PCR检测COX-1 mRNA和t-PA mRNA表达水平

1.5.1血管总RNA的提取及纯化：从冰箱取出样本，液氮环境中粉碎后，采用标准的Trizol法提取血管总RNA，并按照RNA clean Kit试剂盒方法去除蛋白质、无机盐离子和有机杂质。

1.5.2 RNA反转录合成cDNA：按照FastQuant RT Kit试剂盒说明操作。

1.5.3RT-PCR：(1) 引物设计与合成：从美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库下载mRNA序列，利用Primer Premier 引物设计软件根据标准荧光定量PCR引物设计原则，分别设计内参基因β-actin和目的基因COX-1 mRNA、t-PA mRNA的引物碱基序列，见表1。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。(2) RT-PCR反应体系： 参照KAPA SYBR FAST qPCR Kit说明设置RT-PCR反应体系，如表2。每个样品重复3次。(3)RT-PCR反应条件：95℃ 3min；95℃ 3s，60℃ 30s，40个循环。60-95℃绘制熔解曲线。

1.5.4检测结果的量化表达：采用荧光定量PCR仪自带的分析软件分析实验数据，得到同一样本3次测量的Ct平均值，参照以下公式计算各目的基因mRNA的相对表达量2-ΔΔCt，即可量化目的基因mRNA表达水平。

ΔCt(待测样本)=Ct(待测样本，目的基因)-Ct(待测样本，内参基因)；ΔCt(校准样本)=Ct(校准样本，目的基因)-Ct(校准样本，内参基因)；ΔΔCt=ΔCt-ΔCt。校准样本即前述未经离体灌流处理的正常家兔血管段。

表1　待测基因Real-time PCR引物的碱基序列

表2　Real-time PCR 反应体系

1.6统计学处理

应用Statistics 6.0软件，采用二维线性回归方法，分析剪应力(x)与COX-1 mRNA或t-PA mRNA(y)相对表达量的相关性。采用三维非线性方法(二元二次方程)分析剪应力(x)和压力(y)对COX-1 mRNA或t-PA mRNA相对表达量(z)的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1不同剪应力和压力下COX-1 mRNA和t-PA mRNA相对表达水平(表3)

2.2剪应力对COX-1 mRNA和t-PA mRNA表达的影响

二维线性回归结果表明，在表3所述的范围内，剪应力与COX-1 mRNA和t-PA mRNA相对表达水平分别呈显著正相关，回归方程分别为y=0.0261x+0.0886(P<0.01) (图2)和y=0.2033x+1.2082(P<0.01)(图3)。

图2　剪应力与COX-1 mRNA相对表达水平的相关性分析

样本编号剪应力(dyn/cm2)压力(dyn/cm2)COX-1mRNA相对表达水平t-PAmRNA相对表达水平18.3427537.430.272.8124.1924312.850.241.96318.7128343.030.746.0747.3122219.870.232.9755.435129.670.243.08610.5719544.530.321.5274.5411300.440.282.6188.9134842.500.263.05914.9821627.000.443.88109.2744134.450.283.21111.8826508.010.151.27123.2215789.580.231.67135.4218921.440.302.861414.1147870.500.423.72

图3　剪应力与t-PA mRNA相对表达水平的相关性分析

2.3剪应力和压力对COX-1或t-PA mRNA表达水平的联合影响

图4和图 5分别描述了剪应力(x)和压力(y)对COX-1 mRNA和t-PA mRNA相对表达水平的影响，结果分别为COX-1 mRNA = 0.3619-0.0389x+8.8645×10-7y+0.0015x2+1.515×10-6xy-3.1759×10-10y2(P<0.01)和t-PA mRNA=2.9572-0.047x-6.5219×10-5y+0.01x2+2.2973×10-6xy+6.9716×10-10y2(P<0.01)。说明剪应力和压力能以复杂的非线性方式显著影响离体血管COX-1 mRNA和t-PA mRNA水平表达。例如，较高剪应力(>12dyn/cm2)与中等以上压力(>20 000dyn/cm2)配合作用，能上调COX-1 mRNA的相对表达量；较低剪应力(<6dyn/cm2)与较高压力(>35 000dyn/cm2)联合作用，可抑制COX-1 mRNA的表达，而较高剪应力(>12dyn/cm2)联合任何水平的压力，都能上调t-PA mRNA的相对表达量。

图4　剪应力和压力与COX-1 mRNA相对表达水平的关系

图5　剪应力和压力与t-PA mRNA相对表达水平的关系

3　讨　论

动脉血栓的形成与血管壁、血液成分及血流状态的改变等密切相关，是三者相互作用引起的多因素病理过程。血管内皮细胞为衬贴于血管腔面的单层扁平上皮细胞，由中胚层成血管细胞分化而来，沿着血管内壁行单层有序排列，直接与血液的各种成分相接触，是血液、血流、血管三者相互联系的界面和环节[7]。研究发现，剪应力可通过使血管内皮细胞发生生物物理的、生化的和基因调控水平的反应，调节一系列细胞活性因子及黏附因子基因的表达,引起内皮细胞形态、增殖及生理生化的适应性改变[8,9]。血管内皮细胞可分泌多种活性物质，如与血栓形成有关的前列环素(PGI2)，与血栓溶解有关的t-PA等，PGI2具有强烈的扩血管作用和抗血小板聚集作用，是内皮细胞依赖剪切状况而分泌的物质[10]。COX是PGI2合成途径中的关键酶，不同的COX亚型对PGI2表达的影响可能因部位和机体应激状态不同而异。Kawka等[11]发现，COX-1对主动脉中PGI2表达起主要作用。血管内皮细胞能合成、分泌t-PA及其抑制因子(Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1)，t-PA能与纤溶酶原、纤维蛋白形成复合物，使纤溶酶原转变为纤溶酶，引起局部血栓溶解，t-PA 和尿激酶纤溶酶原激活物(Urokinase Plasminogen Activator，u-PA) 与血栓调节蛋白共同作用是体内对抗血栓形成的关键生理机制。一旦t-PA、u-PA 与PAI-1的动态平衡被打乱，可导致血管局部纤维蛋白降解能力降低，使得纤维蛋白易于沉积于这些区域，不利于已形成血栓的溶解[12]。血流剪应力可调控内皮细胞的上述分泌功能而引起的生物效应由多条信号通路协同完成，其机制十分复杂[13]。基于生物学效应角度，剪应力等生物力因素应等效于药理学的多靶点药物，调控血栓形成和血栓溶解等功能[14]。

以往研究剪应力对血管的作用，多采用两种实验模型，即血管模型与细胞培养模型。血管模型可以有效研究在体血管与剪应力的关系，但在体模型因受机体各种因素影响，实验条件难以控制。体外细胞培养模型可以简便有效地控制实验条件，但培养细胞的状况比在体情况简化了许多，如培养的血管平滑肌细胞(Smooth Muscle Cell,SMC)失去其收缩表型而显示出合成表型；原本在细胞反应的调节中有重要功能的内皮细胞与SMC的相互作用及与细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的相互作用也大大减弱，甚至完全消失[6]。本实验采用离体血管段灌流装置，将一段血管在体外施加剪应力培养，不仅保持血管的活性、结构及维持血管细胞的生理功能，还能简便有效地控制实验条件，调节剪应力与压力的大小，使血管在不同水平的生物力作用下产生相应的生物学效应。

液体流动是由压力差驱动的，在研究剪应力对内皮细胞的生物效应时，压力是不可回避的客观因素，并可能单独或与剪应力联合产生生物效应。为了更全面地研究生物力因素对血管内皮细胞产生的生物学效应，本文采用家兔动脉血管段在不同剪应力和不同压力(< 50 000dyn/cm2)下的加载模型，通过研究多剪应力和不同压力水平下家兔离体血管COX-1 mRNA、t-PA mRNA的表达水平，探讨压力如何参与生物学效应。实验结果表明，不论是COX-1 mRNA或t-PA mRNA的表达量 ，它们都以复杂的非线性方式受到剪应力与压力的联合影响，都可以用二元(剪应力与压力)二次方程定量有效地描述。因而提示在研究血流剪应力的生物学效应时，压力的联合效应或单独效应需要充分考虑与量化。而对于不同的生物效应，压力与剪应力联合作用的方式与影响程度不会相同，正如本实验中COX-1 mRNA表达量的二元二次方程与t-PA mRNA表达量的二元二次方程即相去甚远，足以印证此等现象。

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本文第一作者简介：

郝杨阳(1992-)，男，彝族，硕士研究生，研究方向为中药心血管药理

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3Liao FL,Li M,Han D,et al.Biomechanopharmacology:a new borderline discipline[J].Trends in Pharmacol Sci,2006,27(6):287—289.

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5Gambillara V,Chambaz C,Roy S,et al.Plaque-prone hemodynamics impair endothelial function in pig carotid arteries[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(6):H2 320—H2 328.

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13Zhou J,Li YS,Chien S.Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34(10):2 191—2 198.

14廖福龙.活血化瘀研究的生物力药理学途径[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(5):1—5.

The Unavoidable Combined Effect of Shear Stress and Normal Pressure in Investigation of Biological Effects induced by Shear Stress

HAO Yang-yang1，CAO Jun2，YIN Xiao-jie2，GONG Lei-lei2，YUAN Hui-jun1，WANG Lan2，LIANG Ri-xin2,#，LIAO Fu-long2,#

1China Capital Medical University,Beijing 100069,China;2Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;#Corresponding author

Objective:In biomechanopharmacological research,flow chamber or blood vessel segment are frequently applied to study the biological effects of shear stress (SS).Flowing was driven by pressure difference,so the normal pressure is possibly involved in inducing the biological effects.So in attempt to investigate whether pressure could affect the biological effects,the effects of different levels of shear stress and pressure on cyclooxygenase-1(COX-1) mRNA and tissue type plasminogen activator enzyme(t-PA) mRNA in rabbit artery vessels was ex vivo observed.Method:By employing ex vivo arterial perfusion system,the rabbit artery perfusion model was established under different flow conditions of SS (1.5-20dyn/cm2) and mean normal pressure (< 50 000dyn/cm2).And the expression of COX-1 mRNA and t-PA mRNA was measured by real-time PCR method.Results:When considering the effect of SS on COX-1 mRNA and t-PA mRNA expression separately，under flow oondition of SS(1.5-20dyn/cm2) the detection results of real-time PCR of COX-1 mRNA and t-PA mRNA expression (y) showed increased and a significant positive correlation with SS(x),respectively,the linear equation was described:y=0.0261x+0.0886 (P<0.01) and y=0.2033x+1.2082 (P<0.01) accordingly.And we also found that SS(x) and pressure(y) had a significant combined effect on expression of COX-1 mRNA and t-PA mRNA,the binary quadratic equations were established :COX-1 mRNA = 0.3619-0.0389x+8.8645×10-7y+0.0015x2+1.515×10-6xy-3.1759×10-10y2(P<0.01) ; t-PA mRNA = 2.9572-0.047x-6.5219×10-5y+0.01x2+2.2973×10-6xy+6.9716×10-10y2(P<0.01).Conclusion:The combined effects of SS and normal pressure should be considered in biomechanopharmacological research.Our result demonstrates that binary quadratic equation is an effective description quantitatively.

Shear stress；Pressure；Biological effect；Biomechanopharmacology；Rabbit

国家自然科学基金(81473548)

单位]1首都医科大学，北京 100069；2中国中医科学院，北京 100700；

，E-mail:liangrixin2009@sina.com(梁日欣)；fulong_liao@126.com(廖福龙)

本文2016-04-28收到，2016-06-15修回

R318.01[文献标识码]A

1005-1740(2016)03-0001-06