磷脂酰胆碱组分的二维液相色谱分离

郝　丽，朱苑露，代雅楠，段　蓿，韩欣欣，谭成玉，孔　亮，李　伟

（大连海洋大学，辽宁大连　116023）

磷脂酰胆碱组分的二维液相色谱分离

郝丽，朱苑露，代雅楠，段蓿，韩欣欣，谭成玉，*孔亮，*李伟

（大连海洋大学，辽宁大连116023）

建立了以脂质体生物色谱-反相高效液相色谱的离线二维色谱分析方法模型，以磷脂酰胆碱（Phosphatidyl choline，PC）为样品进行色谱分析。首先采用PBS（磷酸盐缓冲溶液）为流动相，流速为0.4 mL/min，以固定相脂质体液相色谱柱（Immobilized lliposomes chromatography，ILC）的一维色谱分离。二维色谱分离采用反相C18色谱柱进行分离，流速为1 mL/min。磷脂酰胆碱在固定相脂质体色谱上仅有1个保留峰，但在反相C18色谱柱上却存在着多个保留峰。因此，由脂质体生物色谱-反相高效液相色谱组成的二维分离色谱在阐释了生物色谱意义的同时也充分体现了二维色谱的分离优越性。

固定化脂质体色谱；二维色谱；磷脂酰胆碱

诠释天然产物组分的关键在于其活性物质的阐明。近年来，在众多重要活性成分的分离技术中，色谱法因其良好的分离效果、多变的分离模式成为分离天然产物中活性成分不可或缺的手段。常规的色谱法大多基于中药活性成分的物理和化学性质进行分离，不可避免地存在着分离过程无法确定分离成分的药理信息等缺陷。为此，可以利用生物色谱法来填补常规色谱的缺陷。其中，脂质体是一种理想的模拟生物膜［1］，能够在体外模拟活性成分的跨膜运输和吸收过程，活性成分与脂质体的结合和其被人体吸收具有很好的相关性［2］。

虽然利用固定相脂质体色谱能够模拟活性成分与生物膜之间的相互作用，体现了活性成分在细胞膜上的穿透能力，但单纯的应用固定相脂质体色谱分离活性物质亦存在着分离度低、分离效果差等不足；反相C18色谱分离具有分辨率高、分离效果好、峰容量高等优点［3］。本文将固定相脂质体色谱与反相C18色谱各自的分离优势相互结合，建立了固定相脂质体-反相C18离线二维分离色谱，在更好地体现了活性成分生物特性信息的同时，也达到了样品各组分间良好的分离效果。

1　试验部分

1.1仪器与设备

Agilent 1260型高效液相色谱仪、Agilent LC型色谱工作站，美国Agilent公司产品；硅胶（5 μm），日本Fuji公司产品；自动馏分收集器（SBS-100型自动计滴部分收集器），上海沪西分析仪器厂有限公司产品；Unitary C18型液相色谱柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），华谱新创科技有限公司产品；Lambda35型可见-紫外分光光度计，美国PERKINELMER公司产品；TGL-16M型高速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；Milli-Q型超纯水净化仪，美国Millipore公司产品；西盟冻干机，美国西盟国际仪器有限公司产品。

蛋黄卵磷脂（PC），日本东京化成工业株式会社产品；磷脂酰胆碱，购自美国sigma科技有限公司；乙腈为色谱纯，百灵威科技有限公司产品；甲醇、异丙醇均为色谱纯，山东蜀王实业总公司产品；磷酸盐。缓冲溶液：50 mmol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液，现用现配。

1.2试验条件与方法

1.2.1ILC色谱柱的制备

磷脂涂覆法并加以改进制备ILC固定相：将3 g硅胶置于20%的盐酸溶液中回流后，用大量的蒸馏水冲洗至中性。在120℃条件下真空干燥过夜，备用。取1.5 g的蛋黄卵磷脂并用30 mL的氯仿溶解，加入预先活化的硅胶3 g，旋转蒸发除去有机溶剂。加入50×10-12mol/L的磷酸盐缓冲溶液，静置溶胀4 h，装柱前用PBS缓冲液洗涤，以转速3 000 r/min离心3次，除去未固载的卵磷脂。采用pH值7.4的PBS缓冲液（无NaCl）为匀浆液，在30 MPa的压力下将预先制备的脂质体固定相装入不锈钢柱管中即可。

1.2.2ILC色谱柱固定化磷含量的测定

利用卵磷脂中磷含量来表征硅胶表面固定化脂质体的含量，其中磷含量的测定方法采用水中总磷含量的测定方法。将未溶胀的涂覆硅胶用超纯水溶胀4 h，干燥后称质量，于浓硫酸中回流硝化，并用超纯水洗涤剩余的硅胶，取硝化液定容后测定。

1.2.3固定相脂质体柱色谱条件

自制I.D.4.6 mm×150 mm脂质体色谱柱；流动相：50mmol/L的磷酸盐缓冲溶液；流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL；柱温：常温；检测波长：208 nm。

1.2.4馏分收集

将经过固定相脂质体色谱检测分离的样品用自动馏分收集器进行收集，将每60 s的馏分收集在1根馏分收集管中。将收集后的馏分进行冻干浓缩，并以不同时间段收集的馏分为第二维反相C18色谱分析的样品，进行分析。

1.2.5反相C18色谱条件

反相C18色谱柱；流动相：甲醇∶乙腈∶异丙醇（80∶10∶10）；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；柱温：常温；检测波长：208 nm。

2　结果与讨论

2.1涂覆法制备ILC色谱柱中磷含量的测定

采用样品中总磷含量的测定方法，以纯水作为参比，于882 nm下测得的吸光度为纵坐标、以相应的磷酸盐质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

磷含量的标准曲线见表1。

表1　磷含量的标准曲线

测得脂质体中的吸光度为0.768，故所测的样本质量浓度为0.62 mg/L，250 mL中所含磷为0.155 mg，则0.725 g硅胶上吸附的磷为0.155 mg，硅胶上的磷含量为0.214 mg/g。

2.2磷脂酰胆碱在ILC色谱柱上的分离情况

磷脂酰胆碱在ILC色谱柱上的分离图谱见图1。

图1　磷脂酰胆碱在ILC色谱柱上的分离图谱

由图1可知，磷脂酰胆碱（PC）在ILC色谱柱上存在保留峰，且只有1个保留峰a。ILC色谱柱是模拟生物细胞膜的脂质体结构，在ILC色谱柱上有保留的成分皆可视为细胞膜通透性的成分。由此可知，在图谱上保留时间长的组分与脂质体的相互作用强，其疏水性强，则与细胞膜的相互作用也可能就强。磷脂酰胆碱（PC）虽然在ILC上只有1个保留峰，但其保留时间长，可知其与脂质体固定相之间存在着相互作用，进而可推断磷脂酰胆碱进入到人体之后与人体细胞膜之间存在着一定的相互作用。由此，利用一维的ILC色谱柱模拟细胞膜环境来判定磷脂酰胆碱的生物特性。但由于生物模拟色谱ILC色谱柱存在着分离效果低的不足，故进行第二维色谱分离的分析。

2.3磷脂酰胆碱在反相C18色谱柱上的分离

二维反相色谱分离磷脂酰胆碱的单组分色谱见图2。

与一维液相色谱分离相比，系统的分辨率显著提高。图2中是对磷脂酰胆碱其中的1个组分进行的反相液相分离结果，在固定相脂质体一维色谱中只分离出了1个峰，在反相液相色谱中1个组分分离出了至少8个峰，体现了反相液相色谱的高分辨率。

二维反相色谱对磷脂酰胆碱全部组分的分离色谱见图3。

图2　二维反相色谱分离磷脂酰胆碱的单组分色谱

图3　二维反相色谱对磷脂酰胆碱全部组分的分离色谱

由图3可知，与固定相脂质体色谱的分离结果相对比，反相液相色谱分离结果中出峰数达186个，峰容量为744个，经过二维的反相液相色谱分离，图谱中相互重叠的谱峰较少，谱峰间的分离度更高，为下一步的试验分析提供了有利条件。

2.4二维反相对磷脂酰胆碱组分的光谱分析

磷脂酰胆碱组分的紫外光谱见图4，未知物质的紫外光谱见图5。

由图2的试验结果中对磷脂酰胆碱的组分进行光谱分析可知，由于磷脂酰胆碱的物质结构特殊，其紫外光谱的吸收较弱，几乎只存在末端吸收，如图4所示。但在对图2中的各个峰进行光谱分析中得到，在7.22 min时出的峰是b3的光谱图，与其他峰的光谱图有所不同，如图5所示。其最大吸收波长于234 nm处，尚不知其具体信息，有待进一步研究。

图4　磷脂酰胆碱组分的紫外光谱

图5　未知物质的紫外光谱

3　结论

本文以磷脂酰胆碱为研究对象，建立了固定相脂质体-反相C18离线二维色谱的分离方法。利用固定相脂质体色谱来模拟细胞膜磷脂双分子层的环境，给出了活性成分的生物信息；且将在与固定相脂质体相互作用的组分进行了二维反相C18分离，给出了活性成分的化学色谱信息，充分的体现了固定相脂质体-反相C18二维色谱的生物特性及分离特性，为今后在天然产物生物活性成分的分离提供了可能。

［1］盛亮洪，李睿岩，李萍，等.固定化脂质体色谱研究中药复方的细胞膜通透性成分及其质量控制 ［J］.分析化学，2004（12）：1 595-1 598.

［2］何丽姗，徐斌，王光忠，等.复方脑得生有效成分与脂质体模拟生物膜相互作用的研究 ［J］.时珍国医国药，2010（4）：804-806.

［3］唐涛，张维冰，李彤，等.六味地黄丸组分的二维液相色谱分离 ［J］.分析化学，2010（12）：1 767-1 771.◇

Analysis of the Phosphatidyl Cholines from Halichondria Rugosa Cell Membrane by Off-line Two-dimensional Liquid Chromatography

HAO Li，ZHU Yuanlu，DAI Ya'nan，DUAN Xu，HAN Xinxin，TAN Chengyu，*KONG Liang，*LI Wei
（Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023，China）

In this paper，phosphatidyl cholines（PCs） in Halichondria Rugosa Cell Membrane are analyzed by the model of immobilized liposomes chromatography（ILC） -RP-HPLC（Off-line two-dimensional liquid chromatography） .Research has revealed that PC retained peaks on liposome chromatography stationary phases and separate well on the RP-HPLC C18.Using established PC model the phospholipid compounds of the marine sponge cell membrane is validation.The results show that he main components of cell membrane are carbohydrates，DNA and proteins have been removed by the first dimensional chromatography（ILC），and the PCs can be separated by the second dimensional chromatography（RP-HPLC）quickly.

PCs；ILC；PC

Q545+.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.08.017

1671-9646（2016）08a-0056-03

2016-05-20

海洋局公益性行业科研专项（201005024-3，201205022-7）。

郝丽（1989— ），女，硕士，研究方向为分析化学。

孔亮（1970— ），男，博士，教授，研究方向为分析化学。

李伟（1964— ），男，博士，教授，研究方向为生物化学。