10%精喹禾灵乳油对斑马鱼的急性毒性试验

赵小会，程翠利，周春姣, 蒋红梅

(湖南农业大学理学院，湖南　长沙　410128)



10%精喹禾灵乳油对斑马鱼的急性毒性试验

赵小会，程翠利，周春姣, 蒋红梅

(湖南农业大学理学院，湖南长沙410128)

农业生产中粮食产量的提高离不开农用除草剂的施用，而施用除草剂的过程中难免会造成环境的污染，进而使环境生物受到迫害。以斑马鱼作为试验用鱼，采用半静态法测定10%精喹禾灵乳油对鱼类的急性毒性。将斑马鱼置于配制好的精喹禾灵药液中进行染毒，利用高效液相色谱法测定斑马鱼经0 h、24 h、48 h、72 h、96 h染毒后水体实际浓度，记录相应浓度下斑马鱼的死亡数目，计算各时间点的致死中浓度，并观察斑马鱼中毒症状。根据化学农药毒性等级划分标准进行分级，确定10%精喹禾灵乳油农药的毒级为高毒。

精喹禾灵；斑马鱼；急性毒性；致死中浓度；高效液相色谱

农药对环境的毒害大多是用药不恰当，超出了环境的自我净化能力造成的，进而通过大气，土壤，水循环等富集到人体。农药对人类有致死、内分泌干扰或三致效应(致癌、致畸和致突变作用)等毒性作用，因此化学农药的大量使用会对人类健康产生严重危害[1]。精喹禾灵是一类乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂，广泛用于大豆、甘蓝、花生等作物的田间除草[2-3]。由于水圈循环、地表径流和浇水灌溉等农事操作，精喹禾灵有污染水体，破坏水生生物生存环境的风险。本文通过测定农药对斑马鱼的LC50，明确其毒性，评价农药对鱼类的急性毒性，提供该农药对生态环境影响的基础数据。

鱼类对水体变化十分敏感，当水体的理化性质发生变化时，鱼类能够率先感应到外部条件的变化而做出相应的反应。当水体有毒物质增加时鱼类就会出现行为异常，如组织细胞病变，甚至死亡。目前进行斑马鱼毒性试验评价农药对环境的影响，已成为一种重要的手段[4]。鱼类急性毒性试验一般以96 h为一个试验周期，每隔24 h观察鱼类中毒症状及其死亡数目，检测水体0 h、24 h药液浓度，当试验药液真实浓度变化不超过理论浓度20%时可用理论浓度计算半致死浓度(即LC50)，根据LC50进行毒级分析。

高效液相色谱由于其高效、灵敏、可靠、低检测限等优势被广泛用于农药残留检测。马建明[5]和丁春霞[6]等应用高效液相色谱检测蔬菜、土壤和烟叶中精喹禾灵残留量，均取得了比较理想的结果。

1　实　验

1.1试验仪器与试剂

L600-P6高效液相色谱仪，北京普析通用仪器有限公司；溶解氧测定仪；ET8010水质总硬度检测仪。

甲醇高效液相色谱淋洗液；10%精喹禾灵乳油；97%精喹禾灵原药；斑马鱼(市售)；试验用水(净水器过滤并曝气处理24 h以上的水)；鱼饵(市售)。

1.2水体中精喹禾灵浓度检测方法的建立

1.2.1液相色谱条件

液相色谱柱选用Pgrandsil-STC-C18；流动相甲醇:水=80:20；检测波长237.0 nm；流速：1.0 mL/min。

1.2.2标准曲线的建立

配制系列浓度梯度精喹禾灵标准溶液(0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L和2.00 mg/L)，按1.2.1液相色谱条件检测，建立精喹禾灵标准曲线。

1.2.3方法精密度考察

将上述0.10 mg/L的标准溶液连续进样三次，按1.2.1液相色谱条件检测，计算标准偏差，变异系数，考察方法精密度。

1.2.4方法准确度考察

将浓度为0.10 mg/L、1.00 mg/L的标准溶液分别添加到两组试验水样中平行进样两次，按1.2.1液相色谱条件检测，计算回收率，考察方法准确度。

1.3急性毒性试验

1.3.1试验用鱼的驯养

试验前斑马鱼在试验室驯养7 d。每天喂食两次，并及时清理水体中的鱼类粪便、食物残渣和死鱼等杂质，试验开始前饥饿处理24 h。

1.3.2半数致死量预浓度范围的确定

选择较大浓度范围(0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L)进行预试验，每个浓度投放10条斑马鱼，设三个平行组，每隔24 h时间点记录斑马鱼死亡数，选取24 h斑马鱼全部死亡浓度(1.0 mg/L)和96 h无死亡浓度(0.5 mg/L)浓度范围进行正式试验。

1.3.3急性毒性试验

根据预试验的结果，设七个不同浓度处理组(分别为0.500 mg/L、0.560 mg/L、0.627 mg/L、0.702 mg/L、0.787 mg/L、0.881 mg/L、0.987 mg/L)。每组设三个重复，设一个空白对照组，挑选相同数量体长均匀，健康，性成熟的斑马鱼进行试验。待斑马鱼在药液中处理0 h、24 h 、48 h、72 h、96 h 后观察斑马鱼的中毒症状，记录水体硬度、溶氧量、pH、水温、斑马鱼的死亡数(0 h除外)。检测不同处理组水体0 h、24 h水体药液的实际浓度。当试验药液实际浓度变化不超过理论浓度20%时，以理论浓度计算半致死浓度(即LC50)。

全部试验符合《化学农药环境安全评价试验准则》水体条件的质量控制要求，即驯养期间斑马鱼死亡率控制在5%以下，空白组斑马鱼死亡率低于10%；光照12～14 h；水温控制在21～25 ℃；试验用水pH控制在7.0左右；水体溶解氧为4.0 mg/L以上；水体硬度为200.0 mg/L左右(以碳酸钙计)。

1.3.4毒级标准的划分与数据处理

根据《化学农药环境安全评价试验准则》，农药对环境的毒性(96 h LC50)分为四个等级即：LC50>10 a.i.mg/L为低毒；1.0a.i.mg/L

2　结果与讨论

2.1精喹禾灵标准曲线的建立

将系列浓度标准溶液按1.2.1液相色谱条件进行测定，以两次进样峰面积平均值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线(图1)。空白水和1.00 mg/L标准溶液液相色谱见图2和图3。

图1　精喹禾灵标准曲线

图2　空白水液相色谱图

图3　1.00 mg/L标准溶液液相色谱图

2.2方法精密度与准确度考察

按1.2.3和1.2.4进行试验，结果见表1，表2，试验水样(添加1.00 mg/L精喹禾灵)高效液相色谱图见图4。

表1　精密度测定结果

表2　准确度测定结果

图4　添加1.00 mg/L标样的水样液相色谱图

由表1、表2试验数据可知，标准偏差较小且方法回收率在80%～110%，符合《化学农药环境安全评价试验准则》，结果可靠。试验水样中目标物精喹禾灵出峰时间为16.933分，与标准溶液17.083分接近，峰形尖而对称，且附近无杂峰干扰，说明液相条件选择恰当，分离效果好。

2.3试验水体条件

本试验采用半静态法，每隔24 h更换一次药液，并去除死鱼。按设定的不同时间点测定试验水体样品在最低、最高浓度时的各项指标，并同时分别测定0 h、24 h时水体中精喹禾灵浓度。在试验时间，含最低浓度和最高浓度的精喹禾灵水体各项指标均符合《化学农药环境安全评价试验准则》中水体条件的质量控制要求。因此，可以认定本次试验所采用的水体均符合质量控制的要求，即本次试验水体条件达标。

2.4试验水体中精喹禾灵实际浓度与理论浓度评价

经测定试验药液实际浓度变化不超过理论浓度20%，可用理论浓度代替实际浓度计算半数致死量。用DPS数据处理系统计算不同时间的半致死浓度(LC50)和95%的置信限，结果见表3。

表3　10%精喹禾灵乳油毒性计算结果表

由计算结果知，精喹禾灵除草剂对斑马鱼96 h的LC50值为0.755 mg/L，通过对比《化学农药环境安全评价试验准则》中毒级划分标准，确定其毒性为高毒。

3　结　论

高效液相色谱法可用于检测水体中精喹禾灵含量，该方法在线性范围内精密度和准确度良好。根据毒级划分标准，10%精喹禾灵乳油对斑马鱼的LC50(96 h)值为0.755，属高毒农药。目前10%精喹禾灵乳油对斑马鱼的急性毒性试验未见有报道。于淑池等在精喹禾灵对泥鳅的急性毒性试验中报道出精喹禾灵对泥鳅的96 h的 LC50为4.45 mg/L,属高毒农药[8]。李言等在精喹禾灵对近似鳞的试验中报道出24 h的LC50为 0.1278 μg/mL[9]。本研究率先以斑马鱼作为试验用鱼采用室内模拟试验，研究精喹禾灵毒性，取得了可信的试验结果，为精喹禾灵大田使用提供参考。

[1]卜元卿,孔源,智勇,等. 化学农药对环境的污染及其防控对策建议[J]. 中国农业科技导报,2014,16(02):19-25.

[2]宗涛,李洁,刘祥英,等. 湖南省部分地区棉田牛筋草(Eleusine indica)对精喹禾灵的抗性[J]. 植物保护,2015,41(02):58-63.

[3]滕芳超,王金信. 山东省大豆田马唐对精喹禾灵、稀禾啶抗药性检测研究[J]. 农药科学与管理,2014,35(03):64-66.

[4]陈爱梅,王金花,夏晓明,等. 不同剂型吡虫啉对蚯蚓和斑马鱼的急性毒性评价[J]. 农业环境科学学报,2013,32(09):1758-1763.

[5]马建明,赵立达,马旭亮. 高效液相色谱法测定蔬菜中精喹禾灵残留研究[J]. 中国卫生检验杂志,2007,17(05):827,924.

[6]丁春霞,龚道新,肖浩,等. 高效液相色谱法测定土壤和烟叶中精喹禾灵的残留量[J]. 应用化工,2012,41(11):1999-2001,2003.

[7]林琎,慕卫,徐瑞雪,等. 鱼体长对鱼类急性毒性试验结果的影响初探[J]. 试验科学与技术,2013,11(06):1-2.

[8]于淑池,郭雯雅. 精喹草除灵对泥鳅的急性毒性及血清同工酶的影响[J]. 水生态学杂志,2013,34(05):82-86.

[9]李言,余昊,王运兵. 5%精喹禾灵乳油对近似鳞的毒力测定[J]. 河南科技学院学报:自然科学版,2012,40(02):34-36.

Acute Toxicity of 10% Quizalofop-p-ethyl on Zebrafish

ZHAO Xiao-hui, CHENG Cui-li, ZHOU Chun-jiao, JIANG Hong-mei

(College of science, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China)

Abstracts：The yield increasing of grain production is closely associated with the application of herbicide, during which, inevitably, environment is polluted and the organism is threaten. A semi static method was used to determinate the acute toxicity of 10% quizalofop-p-ethyl by employing Zebrafishs as experimental fish. The Zebrafishs were exposed to quizalofop-p-ethyl with different concentrations and the high performance liquid chromatography was utilized to detect the actual concentrations of quizalofop-p-ethyl in water after 0 h, 24 h, 48 h, 72 h and 96 h. The results showed the number of deaths of Zebrafishs was in the corresponding with the concentrations of quizalofop-p-ethyl. The median lethal concentration of quizalofop-p-ethyl was calculated, poisoning symptoms of zebrafishs were observed and the quizalofop-p-ethyl pesticides were judged as a highly toxic according to the classification standard of herbicide.

Quizalofop-p-ethyl; Zebrafish; acute toxicity; median lethal concentration; high performance liquid chromatography

X592

A

1001-9677(2016)016-0108-03