丹参药渣中丹参酮类化学成分的提取富集研究及其利用途径分析△

戴新新，沈飞，宿树兰*，段金廒*，唐志书，赵步长，王明耿

(1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.山东菏泽步长药业股份有限公司，山东 菏泽 274000)

丹参药渣中丹参酮类化学成分的提取富集研究及其利用途径分析△

戴新新1，沈飞1，宿树兰1*，段金廒1*，唐志书2，赵步长3，王明耿3

(1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.山东菏泽步长药业股份有限公司，山东 菏泽 274000)

目的：对丹参药渣中丹参酮类成分的提取富集工艺进行优化，并进一步对其开发利用进行分析。方法：采用L9(34)正交试验设计，以总丹参酮的含量为评价指标，优选丹参药渣的最佳提取工艺条件；采用溶剂沉淀法纯化富集丹参酮类成分。结果：丹参药渣中丹参酮类成分的最佳提取工艺为乙醇体积分数为90%，10倍乙醇用量，提取2 h，提取2次；通过水沉淀法可以去除丹参粗提物中大多数的水溶性成分，纯化制备丹参酮类化学成分，其中提取物中总丹参酮的含量为1.752%，是原提取物含量的7.5倍。结论：本文优选了丹参药渣中总丹参酮的最佳提取工艺，并采用水沉淀去除部分水溶性成分，从而富集纯化丹参酮类成分。建立了采用HPLC同时测定丹参药渣中总丹参酮含量的方法，操作简便快速、重现性好，为丹参药渣的资源化利用及质量控制提供科学依据与参考。

丹参药渣；丹参酮；提取制备；纯化工艺

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功能[1]。用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风、冠心病、心绞痛、心肌梗死等症的治疗[2]。丹参中的资源性化学成分主要包括脂溶性和水溶性成分[1，3]，脂溶性的丹参酮类化合物主要包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ等，具有抗氧化[4]、心血管药理作用[5]、抗菌消炎作用[6]以及抗肿瘤作用[7]等多种生物活性。丹参类注射液制备生产过程主要采用水提醇沉工艺，致使脂溶性成分丹参酮类残留在药渣中，未得到充分利用导致丹参资源性化学物质的浪费和资源利用效率低，同时造成环境污染。该问题已引起政府、相关部门以及从事中医药研究的科技工作者的关注和高度重视。

本文在前期研究基础上，建立同时测定丹参药渣中二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的HPLC-PDA分析方法，研究发现丹参药渣中残留大量的丹参酮类资源性化学成分。为了有效利用丹参酮类化学成分，本文采用正交设计法优化丹参药渣中丹参酮类成分的提取工艺条件，以总丹参酮类成分含量为评价指标，明确有利于生产、节约成本的最佳提取工艺，并采用溶剂沉淀法纯化富集丹参酮类成分，为丹参药渣的资源化利用、利用价值发现以及资源产业化奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

美国 Water 2695 高效液相色谱系统，Water 2998 PDA检测器，Empower数据管理系统，FW80型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，ML204/02、MS205电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，TDL-80-2B型离心机(上海安亭科学仪器有限公司)，KH-500型超声波清洗仪器(昆山禾创声波仪器有限公司)。

1.2 试剂与药材

甲醇(南京化学试剂有限公司)、甲酸(MERCK)均为分析纯，乙腈(美国TEDIA公司)为色谱纯试剂。二氢丹参酮Ⅰ(南京春秋生物工程有限公司，批号：20140516)，丹参酮Ⅰ(批号：110867-200406)、隐丹参酮(批号：110852-200806)和丹参酮ⅡA(批号：110766-200619)购自中国食品药品检定研究院，无水碳酸钠(南京化学试剂有限公司，批号：14042210905)，水为实验室自制超纯水。丹参固体废弃物在2014年3月收集于菏泽步长制药有限公司。

2 方法

2.1 试验设计

根据预试单因素实验结果及参考相关文献[8-10]，对影响丹参酮提取量较大的几个因素：乙醇用量、乙醇体积分数、提取次数、提取时间进行正交试验设计，以总丹参酮的含量为观察指标，选择乙醇用量、提取次数、提取时间及乙醇体积分数为考察因素[11]，以L9(34)方法设计正交试验，因素水平见表1。

表1 丹参酮类成分提取试验因素水平表

2.2 提取工艺

丹参药渣(水提后)60 ℃温度下烘干后，取干燥药渣打粉，过20 mesh筛，准确称取丹参药渣30 g，共计9份，按正交试验因素水平表条件提取，滤纸过滤得到滤液后浓缩，最终得到干燥固体物，精密称取适量固体，置500 mL量瓶中，加乙醇溶液溶解至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取上清液过0.22 μm的滤膜，进样。

2.3 纯化工艺

2.3.1 丹参药渣醇提取液的制备 准确称取丹参药渣粉末17 g，共计6份，分为3组，每组平行2份，分别为对照组、水沉淀组、碳酸钠沉淀组，均采用正交试验中总丹参酮的最佳提取工艺提取，滤纸过滤得到滤液后浓缩，得丹参药渣浓缩液。

2.3.2 溶剂沉淀法 对照组将浓缩液水浴挥干，在105 ℃干燥 3 h至恒重，精密称量固形物重量；水沉淀组加适量的超纯水，4 ℃冷藏24 h，使完全沉淀，滤纸过滤得沉淀，在105 ℃干燥3 h至恒重，精密称量固形物重量；碳酸钠沉淀组加适量8%碳酸钠溶液，4 ℃冷藏24 h，使完全沉淀，滤纸过滤得沉淀，在105 ℃干燥3 h至恒重，精密称量固形物重量。分别精密称取上述固形物适量，加甲醇溶解并稀释。取上清液过0.22 μm的滤膜，进样。计算固形物中指标成分的含量及在固形物中的含量。

2.4 对照品溶液的制备

分别精密称取二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品适量，用甲醇配成质量浓度分别为0.024 8、0.152、0.209、0.126 mg·mL-1的对照品储备液。

2.5 色谱条件

色谱柱：BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL。以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相进行梯度洗脱：0～8 min，15%A；8～9 min，15%～28%A；9～20 min，28%A；20～22 min，28%～54%A；22～28 min，54%A；37～38 min，54%～60%A；38～43 min，60%～68%A；43～48 min，68%～70%A；48～52 min，70%～15%A，样品的HPLC色谱如图1所示。

注：A.丹参对照品，B.丹参药渣；1.二氢丹参酮Ⅰ；2.丹参酮Ⅰ；3.隐丹参酮；4.丹参酮ⅡA。图1 丹参对照品及丹参药渣的HPLC图

2.6 方法学考察

2.6.1 标准曲线的绘制 取适量二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品，进样1、2、5、10、20 μL；按2.5项下色谱条件进样记录峰面积积分值。以峰面积积分值A为纵坐标，进样浓度C为横坐标，得二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的回归方程。

2.6.2 重复性试验 按照2.2项方法制备6份样品溶液，按2.5项下色谱条件测定二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量，计算其RSD。

2.6.3 精密度试验 连续进样对照品液6次，按2.5项下色谱条件测定二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量，计算其RSD。

2.6.4 稳定性试验 取供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、20 h进样，按2.5项下色谱条件每隔4 h，对同一批供试品溶液测定1次，测定6次，计算其RSD值。

2.6.5 回收率试验 精密称定已知含量的样品3份，加入适量对照品，混匀，按照2.2项方法处理，测定有效成分的含量，计算加样回收率。

2.7 样品分析测定

精密吸取样品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，计算样品中二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量。

3 结果与分析

3.1 方法学考察

通过测定线性关系、稳定性、重复性及精密度，对所建立的HPLC-PDA方法进行验证考察，表2测定结果显示，所测得化合物其RSD小于5%，回收率在94.63%～102.1%，RSD小于2.23%。以上结果表明本实验可以用于样品中这4个丹参酮成分的检测。

3.2 丹参药渣中各类成分正交试验结果

参药渣中各类成分正交试验结果见表3。

3.3 总丹参酮的正交试验结果

总丹参酮的正交试验结果见表4，方差分析见表5。由结果可知，乙醇含量、提取时间和提取次数对总丹参酮的提取结果均有统计学差异，其中影响因素由高到低依次为B、D、C、A，最佳水平为A1B2C2D2，乙醇体积分数为90%，10倍乙醇用量，提取2 h，提取2次。

表2 线性回归方程、稳定性、精密度、重复性和回收率试验

表3 正交试验测定丹参废弃物中丹参酮成分含量 /mg·g-1

表4 总丹参酮正交试验结果

表5 方差分析

3.4 溶剂沉淀法结果

溶剂沉淀法纯化丹参药渣中丹参酮类成分结果见表6。由结果可知，通过溶剂沉淀法可以去除丹参粗提物中大多数的水溶性成分，纯化制备丹参酮类化学成分，其中水沉淀法中总丹参酮提取率是原来粗提物含量的7.5倍。

表6 溶剂沉淀法纯化丹参药渣中丹参酮类成分含量 (%)

4 讨论

4.1 提取溶剂的选择

丹参酮类成分为脂溶性成分，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷等有机溶剂，不溶于水，考虑到工业扩大生产的适用性和可行性，本实验工艺采用乙醇作溶剂，并优化其乙醇浓度，优选出经济实惠的丹参酮类物质提取溶剂。

4.2 提取纯化工艺的优化

本实验以总丹参酮为指标，考察其最佳提取工艺，发现乙醇用量和乙醇浓度是影响提取效果的关键因素，最终确定了适应总丹参酮的最佳提取工艺，10倍量的90%乙醇水溶液，提取2次，每次2 h。本实验通过溶剂沉淀法进一步纯化丹参药渣中的丹参酮类成分，实验结果表明，水沉淀法可去除丹参粗提物中大多数的水溶性成分，纯化制备丹参酮类化学成分，其中总丹参酮提取率是原来粗提物含量的7.5倍。研究结果为丹参药渣中丹参酮类资源性化学成分的综合开发利用和精细化利用提供了科学依据，为提升丹参资源的利用效率提供了可行性制备工艺。研究中采用的溶剂沉淀法纯化丹参酮类成分后，更有利于其进一步精制制备，以提高丹参酮类成分的纯度和利用价值，为丹参药渣的产业化及高值化利用提供了研究基础。

4.3 丹参酮类成分的利用途径与价值

现代研究表明，丹参酮类成分具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量及抗菌、抗炎等多种生物活性和应用价值，尤其是其在抗肿瘤活性方面尤为突出[12]。郝文慧等[13]研究表明，丹参酮类成分具有显著的抗肿瘤活性，具有良好的开发前景。目前含有丹参酮类的药品也有很多种，主要有丹参酮片、丹参酮胶囊、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液、丹参酮油膏、丹参舒心胶囊、复方丹参滴丸、丹参舒心片、精制冠心片等[14]。此外，丹参酮类成分在保健产品、化妆品等领域亦显示出广泛的应用价值，这将有助于拓展丹参酮类的利用途径，提升丹参资源的利用效率，有助于丹参酮类资源性化学物质的产品开发及产业链延伸。同时，丹参资源的综合利用更有利于生态效益与社会经济效益的平衡与协调发展。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：76-77.

[2] 钱正清.最新中药大辞典[M].北京：中国中医药出版社，2012：478-480.

[3] LIU J J，LIN D J，LIU P Q，et al.Induction of apoptosis and inhibition of cell adhesive and invasive effects by salvia in acute promyelocytic leukemia cellsinvitro[J].J Biomed Sci，2006，13(6)：813-823.

[4] DING M，YE T X，ZHAO G R，et al.Aqueous extract ofSalviamiltiorrhizaattenuates increased endothelial permeability induced by tumor necrosis factor-α[J].Int Immunopharmacol，2005，5(11)：1641-1651.

[5] TAKAHASHI K，OUYANG X，KOMATSU K，et al.Sodium tanshinone IIAsulfonate derived from DanShen (Salviamiltiorrhiza) attenuates hypertrphy induced by angiotensin II in cultured neonatal rat cardial cells[J].Biochem Pharmacol，2002，6(4)：745-750.

[6] 杜成友，沈文津，李可洲，等.丹参抗犬感染性休克的作用[J].华西医学，1997，12(1)：51.

[7] 叶因涛，徐文清，仲巍.隐丹参酮对宫颈癌Hela细胞增殖及细胞凋亡的影响[J].中国中药杂志，2010，5(1)：118.

[8] 石岭，鱼红闪，金凤燮.丹参药渣中丹参酮的提取研究[J].安徽农业科学，2010，38(9)：4539.

[9] 李伟，陈兴.丹参中丹参酮ⅡA醇提取工艺研究[J].中国实用医药，2010，5(6)：37.

[10] 陈红霞，陈芳芳，颜新宇.丹参中丹参酮ⅡA三种提取方法的比较研究[J].中国现代药物应用，2010，4(4)：167.

[11] 刘常青，何百寅，冯峰，等.正交试验优选水提后丹参药渣中丹参酮ⅡA的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(9)：32-34.

[12] 李建恒，乔亚君，侯力峰，等.丹参脂溶性有效成分丹参酮研究进展[J].河北大学学报(自然科学版)，2015，35(2)：217-224.

[13] 郝文慧，赵文文，陈修平.丹参酮类抗肿瘤作用与机制研究进展[J].中国药理学通报，2014，30(8)：1041-1044.

[14] 胡荣，罗先钦，励娜，等.丹参酮缓释微囊的制备工艺研究[J].中草药，2012，43(11)：2173-2176.

StudyonEnrichmentofTanshinonesinSalviamiltiorrhizaResiduesandApplicationAnalysis

DAI Xinxin1，SHENFei1，SUShulan1*，DUANJin’ao1*，TANGZhishu2，ZHAOBuchang3，WANGMinggeng3

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China；3.ShandongBuChangPharmaceuticalCompanyLimited，Heze274000，China)

Objective：To optimize the extraction and enrichment process of tanshinones in the Salvia miltiorrhiza residues. and analysis the development and utilization of Salvia miltiorrhiza residues for further.Methods：The extraction conditions ofSalviadregs was optimized by using the L9(34) orthogonal test，with the amount of total tanshinone as evaluation index.Tanshinones were purified and accumulated by solvent precipitation.Results：The optimum parameters for extraction process of the total tanshinone were as follows：10 times amount of 90% ethanol，extracting for 2 times，each time 2 h.Water precipitation could enrich salvianolic acids.The content of the total tanshinone was 1.752%，7.5 times as in original crude extracts.Conclusion：This paper select the best extracting technology of tanshinones in in the Salvia miltiorrhiza residues, and uses the water precipitation to remove part of the water soluble component, purification and enrichment tanshinones. and established a method for determination of tanshinones from Salvia miltiorrhiza residues in content by HPLC method, and this method is simple, fast and reproducible, and can be a reference for the quality control of the extract of Salvia miltiorrhiza residues.and provide scientific basis and reference for the resource utilization and quality control of Salvia miltiorrhiza residues.

SalviamiltiorrhizaBge.dregs；tanshinones；extraction preparation；purification process

2016-01-13)

江苏省“333高层次人才培养工程”资助项目(BRA2015391)；江苏高校中药资源产业化过程协同创新中心建设重点项目(ZDXM-2-5)

*[通信作者] 宿树兰，副教授，研究方向：中药资源化学与方药功效物质基础， E-mail：sushulan@njutcm.edu.cn；段金廒，教授，博士生导师，中国自然资源学会中药及天然药物资源研究专业委员会主任委员，国家“973计划”项目首席科学家，研究方向：中药资源化学与资源循环利用，Tel：(025)85811116，E-mail：dja@njutcm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.010