正交试验优化超声辅助豆腐柴总黄酮提取工艺

黄宏轶， 黄玲艳， 张海燕， 李京雨， 孙 翌，彭 景

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州 225127)



正交试验优化超声辅助豆腐柴总黄酮提取工艺

黄宏轶， 黄玲艳， 张海燕， 李京雨， 孙 翌，彭 景*

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州 225127)

[目的]探索豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。[方法]在超声辅助和单因素试验基础上，采用三因素三水平正交试验优化得到豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。[结果]豆腐柴总黄酮最佳提取工艺为∶液料比为40∶1(mL/g)，乙醇体积分数为70%，超声温度为70 ℃，提取时间为30 min。在此条件下，豆腐柴总黄酮提取率为83.1 mg/g。[结论]正交试验优化超声提取工艺能够显著提高豆腐柴总黄酮的提取率。

豆腐柴；总黄酮；正交试验；工艺优化

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz)学名腐婢，又叫观音草、 臭常山、 满山香和铁箍散等，在我国主要分布于长江流域以南，其根、茎、叶均可入药[1]。豆腐柴含有丰富的对人体有益的物质，如果胶、蛋白质、纤维素和过氧化物酶、黄酮类等，黄酮类化合物具有调节血脂、消除氧自由基、消除炎症、抗肿瘤、预防紫外线损伤等多种生理活性[2-4]。豆腐柴作为一种药食两用植物，利用历史悠久，作为食品、药品、保健品均具有较高的开发利用价值[5]，研究发现豆腐柴叶中总黄酮的提取率为6%[6]。该试验在超声辅助、单因素试验基础上，采用正交试验对豆腐柴中总黄酮提取工艺进行优化。

1　材料与方法

1.1试材豆腐柴，采摘自浙江省浦江县仙华山，除杂、清洗、干燥、粉碎、过100目筛，密封储存于4 ℃冰箱。槲皮素(北京索莱宝生物技术有限公司)；甲醇、无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、氯化铝，均为分析纯。

1.2仪器BL3-120C超声清洗器(上海比朗仪器有限公司)；BS224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Spectrumlab755s紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；SHZ-III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3方法

1.3.1豆腐柴总黄酮的超声辅助提取。精确称量0.2 g豆腐柴，加入一定比例的提取溶剂，在不同条件下超声辅助提取总黄酮，抽滤后取滤液，用蒸馏水定容至25 mL。

1.3.2总黄酮的测定。采用NaNO2-AlCl3-NaOH方法[7]，稍作改动。以槲皮素为标样制作标准曲线，精确称取3 mg的槲皮素，甲醇溶解并定容至10 mL，配成浓度为300 μg/mL的标准溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于试管中，加入600 μL蒸馏水、300 μL 5%亚硝酸钠，振摇，并在暗处反应6 min，加入600 μL 10%三氯化铝，振摇，在暗处反应5 min，加入2 mL 4%氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至5.6 mL，在755 nm处测吸光度值。得到槲皮素质量浓度ρ(μg/mL)与吸光度x的回归方程为ρ=0.001 64x-0.019 33，R2=0.992 9(图1)。用同样方法测定待测定豆腐柴提取液的吸光度。

总黄酮提取率的计算公式为M=C×N/(m×V×1 000)，式中，M为豆腐柴中总黄酮的含量(mg/g)；C为根据标准曲线计算出的待测液的总黄酮含量(μg)；V为待测液体积(mL)；m为豆腐柴的质量(g)；N为豆腐柴提取液的体积(mL)；1 000为换算倍数。

图1　黄酮标准品槲皮素标准曲线Fig.1　The standard curve of flavonoids quercetin

1.3.3单因素试验。

1.3.3.1液料比对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、超声时间20 min的条件下，分别采用液料比20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1(mL/g)的体积分数为70%的乙醇溶液提取豆腐柴总黄酮，考察液料比对总黄酮提取率的影响。

1.3.3.2乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、超声时间20 min、液料比60∶1的条件下，分别采用体积分数20%、40%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液提取豆腐柴总黄酮，考察乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。

1.3.3.3提取温度对总黄酮提取率的影响。在乙醇体积分数70%、液料比60∶1的条件下，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下超声提取20 min，考察提取温度对总黄酮提取率的影响。

1.3.3.4提取时间对总黄酮提取率的影响。在超声温度50 ℃、乙醇体积分数70%、液料比60∶1的条件下，分别提取10、20、30、40、50 min，考察提取时间对总黄酮提取率的影响。

1.3.4正交设计优化工艺。在单因素试验基础上，固定液料比40∶1，以提取温度(A)、提取时间(B)、乙醇体积分数(C)为考察因素，采用L9(34)正交试验优化豆腐柴总黄酮提取工艺(表1)。

表1　正交试验因素水平

1.4数据处理数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析，P<0.05为统计学显著差异的标准。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1液料比对总黄酮提取率的影响。由图2可知，总黄酮提取率随着料液比的增大先增加后逐渐趋于平缓，可能是因为总黄酮的浸出量已经达到饱和。从节约溶剂方面考虑，将液料比确定为40∶1。

图2　超声波提取液料比对总黄酮提取率的影响Fig.2　Effects of solid-liquid ratio on total flavonoids yield

2.1.2乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。由图3可知，随乙醇体积分数的增加，豆腐柴总黄酮提取率先增加后下降，当乙醇体积分数达70%时，总黄酮提取率达最大值(76.3 mg/g)。因此确定总黄酮的最佳提取乙醇体积分数为70%。

图3　乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.3　Effects of ethanol volume fraction on total flavonoids yield

2.1.3提取温度对总黄酮提取率的影响。由图4可知，随着超声温度的增加，总黄酮提取率先增加后下降，当提取温度达70 ℃时，总黄酮提取率达最大值(78.5 mg/g)。因此确定豆腐柴的最佳提取温度为70 ℃。

图4　提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4　Effects of extraction temperature on total flavonoids yield

2.1.4提取时间对总黄酮提取率的影响。由图5可知，随着提取时间的增加，总黄酮提取率先增加后下降，当提取时间达30 min时，总黄酮提取率达最大值(82.0 mg/g)。因此确定豆腐柴总黄酮的最佳提取时间为30 min。

图5　提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.5　Effects of extraction time on total flavonoids yield

2.2正交试验从表2可以看出，各因素对总黄酮提取率影响顺序从大到小依次为C、B、A，且方差分析发现，C有极显著性影响(P<0.01)，B、A有显著影响(P<0.05)，即乙醇

体积分数对豆腐柴总黄酮提取率的影响最大，其次是提取时间、超声温度。从提取率和节约原料方面考虑，豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺为A2B2C2，即液料比40∶1、乙醇体积分数为70%、超声温度70 ℃、提取时间30 min。

表2　正交试验结果

2.3验证试验为进一步验证正交试验结果的可靠性和重复性，按照所得最佳条件做了3次平行试验。结果表明，使用该方法优化出了超声辅助豆腐柴总黄酮的最佳工艺条件，在该条件下总黄酮提取率为83.1 mg/g，不但提取率高，且试验的重现性好。

3　结论

该研究在超声辅助和单因素试验基础上，采用三因素三水平正交试验优化豆腐柴总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，豆腐柴总黄酮最佳提取工艺为液料比40∶1( mL/g)、乙醇体积分数70%、超声温度70 ℃、提取时间30 min。在此条件下，豆腐柴总黄酮提取率为83.1 mg/g。

[1] 汪海斌,王燕燕. 豆腐柴有效成分及药理作用[J].医药导报,2015,34(4):492-494.

[2] 张强,赵新淮.总黄酮和总黄酮醇诱导人食管癌细胞周期停滞的分子机制[J].生物化学与生物物理进展,2008(9):1031-1038.

[3] KESHARI A K,KUMAR G，KUSHWAHA P S，et al.Isolated flavonoids from Ficus racemosa stem bark possess antidiabetic,hypolipidemic and protective effects in albino Wistar rats[J].Journal of ethnopharmacology,2016,181:252-262.

[4] AMBRIZ-PEREZ D L,BANG W Y,NAIR V,et al.Protective role of flavonoids and lipophilic compounds from jatropha platyphylla on the suppression of Lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in macrophage cells[J].Journal of agricultural and food chemistry,2016,64(9):1899-1909.

[5] 高燕妮,路峰,高昂,等.豆腐柴药学研究概况[J].安徽农业科学,2011,39(32):19811-19812.

[6] 曹稳根,段红,翟科峰,等.正交试验优选豆腐柴叶总黄酮的微波提取工艺[J].光谱实验室,2013,30(5):2174-2177.

[7] MOUZA K N,AL-GHUDANI,MOHAMMAD A H.Determination of total phenolics,flavonoids and antioxidant activity of root crude extracts ofAdeniumobesumtraditionally used for the treatment of bone dislocations and rheumatism[J].Asian pacific journal of tropical disease,2015,5(S1):155-158.

Optimizing the Ultrasound-assisted Extraction Techniques for Total Flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz by Orthogonal Test

HUANG Hong-yi,HUANG Ling-yan,ZHANG Hai-yan,PENG Jing*et al

(College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225127)

[Objective] To optimize the extraction techniques using for extracting total flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz. [Method] On the basis of ultrasound assisted and single factor test,the optimal extraction technique was obtained through three factors and three levels orthogonal test. [Result] The optimal extraction conditions were obtained as following: using 70% ethanol with a solid/liquid ratio of 40∶1 mL/g and extraction at 70 ℃ for 30 min. Under the above conditions,83.1 mg/g flavonoids could be extracted fromPremnamicrophylla. [Conclusion] The orthogonal test optimal ultrasound-assisted extraction technique can significantly improve the yield of total flavonoids fromPremnamicrophylla.

PremnamicrophyllaTurcz; Total flavonoids; Orthogonal test; Technique optimization

黄宏轶(1992- )，男，江苏南通人，硕士研究生，研究方向:基础营养学。*通讯作者，副教授，硕士生导师，从事基础营养学研究。

2016-04-18

R 284.2

A

0517-6611(2016)18-132-02