常规精液检查及优化处理后的精液参数对常规IVF受精结局的预测价值

孙青，李观贵，熊风，成金泉，万才云，彭月婷，黄菊，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳　518045；2.深圳中山生殖与遗传研究所，深圳　518045)



常规精液检查及优化处理后的精液参数对常规IVF受精结局的预测价值

孙青1，2，李观贵1，2，熊风1，2，成金泉1，2，万才云1，2，彭月婷1，2，黄菊1，2，曾勇1，2*

(1.深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳518045；2.深圳中山生殖与遗传研究所，深圳518045)

目的分析促排卵前常规精液检查及取卵当日处理后的精液参数对常规体外受精(IVF)结局的预测作用和影响。方法回顾性分析2011年1月至2014年12月期间2 647个常规IVF治疗周期。根据受精率是否低于50%，将患者分为低受精率组(受精率<50%，n=157)和正常受精率组(受精率≥50%，n=2 490)。比较两组患者间的基础资料、精液参数、胚胎发育、胚胎种植率以及临床妊娠情况。采用多因素logistic回归和受试者工作特征曲线(ROC)分析促排卵前常规精液检查及取卵当日的各种单一或综合精液参数指标对IVF低受精率的预测能力。结果除不育年限(P<0.05)外，两组间的基础资料包括女方年龄、男方年龄、女方BMI、获卵数、移植胚胎数和男性不育原因构成比均无统计学差异(P>0.05)。相比于正常受精率组，低受精率组的卵裂率(90.69%vs. 95.98%)、优质胚胎率(40.54%vs. 50.89%)、胚胎种植率(18.91%vs. 31.86%)以及临床妊娠率(35.67%vs. 57.15%)均显著降低(P<0.05)。两组间各项精液参数的差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示促排卵前常规精液检查指标中正常形态精子百分率(aOR0.935；95%CI:0.898-0.974)和正常形态前向运动精子总数(aOR0.299；95%CI:0.143-0.623)，以及取卵日优化处理后的活动精子百分率(aOR0.972；95%CI:0.957-0.988)对预测低受精率的发生具有统计学意义。ROC分析结果显示常规精液检查中的正常形态前向运动精子总数和优化处理后的活动精子百分率的曲线下面积均为0.636，大于正常形态精子百分率的曲线下面积0.604。结论精液常规检查中的正常形态前向运动精子总数和优化处理后的活动精子百分率可作为预测常规IVF低受精率的指标。

常规IVF；活动精子百分率；活动精子总数；受精率

【Abstract】

Objective：To investigate the predictive value of semen parameters in routine semen analysis and after optimal selection on the day of ovum pickup (OPU) in fertilization outcome in patients undergone conventional IVF (cIVF).

Methods：The data of 2 647 cIVF cycles from January 2011 to December 2014 were retrospectively analyzed. The cycles were divided into two groups：low fertilization rate (FR) group (<50%，n=157) and normal FR group (≥50%，n=2 490). Baseline characteristics，semen parameters in routine semen analysis and after optimal selection on the OPU day，embryo development，implantation rate and clinical pregnancy outcome were compared between the two groups. Logistic regression and receiver operating characteristic curve (ROC) were used to determine which semen parameters could be used to predict the occurrence of low FR.

Results：No significant differences were found in female age，male age，female BMI，number of oocytes retrieved，number of embryos transferred，and constituent ratio of male infertile factors (P>0.05)，except infertility years (P<0.05) between the two groups. However，the cleavage rate (90.69% vs. 95.98%)，good quality embryo rate (40.54% vs. 50.89%)，implantation rat (18.91% vs. 31.86%) and clinical pregnancy rate (35.67% vs 57.15%) in low FR group were significantly lower than those in normal FR group (P<0.05). Moreover，all the semen parameters showed significant differences between the two groups. Analysis of logistic regression demonstrated that normal morphology sperm rate (NMSR) (aOR0.935；95%CI:0.898-0.974) and total normal progressive sperm count (TNPS) (aOR0.299；95%CI:0.143-0.623) in routine semen analysis and the motile sperm rate (MSR) (aOR0.972；95%CI:0.957-0.988) after optimal selection on the OPU day had significance for predicting the occurrence of low FR. Furthermore，ROC results showed that the area under the curve (AUC) of TNPS in routine semen analysis and MSR after optimal selection were all 0.636，which is larger than that of NMSR in routine semen analysis (AUC=0.604).

Conclusions：TNPS in routine semen analysis and MSR after optimal selection may be as index for predicting the occurrence of low fertilization in cIVF.

(JReprodMed2016，25(9)：787-793)

大约50%的不孕不育症是由男方因素引起的[1]。不良生活习惯和某些特殊职业及泌尿生殖系统炎症感染等因素是男性精液质量下降的重要原因[2]。精液常规检查是临床上辅助生殖技术(ART)治疗前评估男性生殖功能的一个基本的、重要的项目[3]，同时也对预测ART结局及ART技术方式选择有一定的参考价值[4-5]。然而，单一精液参数的某个特定值不能准确预测行ART夫妇的受孕潜能[3]。例如，有研究表明根据世界卫生组织(WHO)《人类精液检查与处理实验室手册》第5版(以下简称第5版手册)精子形态标准预测IVF结局有一定的局限性[6]。近几年，有研究报道综合精液参数——促排卵前常规精液检测中正常形态前向运动精子总数对IVF受精率有重要的影响，可作为一个独立的精液质量评价指标指导ART治疗[7]。但也有研究认为取卵日优化处理后的各项精液参数在预测精子的IVF能力方面有重要意义，尤其是优化处理后的精液活力[8]或前向运动精子总数[9]与IVF受精率密切相关。然而，到目前为止还没有研究对促排卵前常规精液检测以及取卵日优化处理后的单一或综合精液参数对IVF受精结局的预测价值进行评估。

材料与方法

一、研究对象

回顾性分析2011年1月至2014年12月期间在本中心接受常规IVF治疗的2 647个取卵周期。

入选标准为：(1)第一周期；(2)女方采用标准方案(1 969例)、常规长方案(660例)、短方案(17例)、超超长方案(1例)进行控制性超排卵；(3)女方排除输卵管积水、子宫内膜异位症、子宫肌瘤等因素；(4)新鲜手淫取精标本；(5)新鲜周期移植胚胎。

我们中心在D1(取卵日定为D0)观察常规IVF的受精情况，若受精率低于50%，则进行晚期补行卵胞浆内单精子注射(ICSI)(简称“晚补ICSI”)，因此将受精率为50%作为切割点，将患者分为两组：低受精率组(受精率<50%，157例)，正常受精组(受精率≥50%，2 490例)

二、诊疗回顾

1.促排卵前常规精液检测与处理：取卵日前最近3个月内，参照WHO第5版手册的标准程序进行精液的采集及处理。采用Makler计数池(Sefi-Makler，以色列)载样于SCA计算机辅助精液分析操作系统(Microptic，西班牙)，进行精子浓度及活力分析；精子形态学分析采用Diff-Quik快速染色液(Medion Diagnostics，瑞士)进行染色，并且根据第5版手册的精子形态学诊断标准进行人工分析。

2.IVF术前精液处理：男方禁欲3～7 d，于取卵日以手淫法取精，室温液化后，记录精液量、液化时间。密度梯度离心法处理精子，并采用计算机辅助精液分析操作系统检测精子密度、活动率、a+b级精子比例，然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养直至授精。

3.控制性超排卵和卵母细胞收集：超排卵采用本中心标准方案、常规长方案、短方案以及超超长方案，当优势卵泡直径≥18 mm时，肌注HCG(丽珠制药)，注射后34～36 h左右行阴道B超穿刺取卵，卵母细胞放入培养液中培养直至授精。

4.体外受精和胚胎培养：卵母细胞培养3～5 h后授精，加入精子量为每个卵母细胞5～10万个精子。受精后16～18 h去除卵丘细胞，观察受精情况，出现2个原核为正常受精。观察受精后胚胎的卵裂及发育情况。受精后72 h根据本中心实际情况制定的胚胎评分系统评判胚胎分级，然后选择2～3个优质胚胎移植。

5.妊娠结局判断：胚胎移植后14 d后验尿HCG，呈阳性为生化妊娠。移植后5周超声检查见子宫腔内妊娠囊及原始搏动即确定为临床妊娠。

三、统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差表示，若样本呈正态分布，两组组间比较用独立样本t检验，若为非正态分布，则采用非参数检验的Mann-Whitney U检验；计数资料组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

用多因素logistic回归分析不同精液参数对低受精率的影响，获得比值比(OR)和95%的置信区间(CI)。多因素分析采用进入方法进行回归分析。参数中以总数表示的数据转换为log以10为底的对数，进行多因素分析。将女方年龄、男方年龄、不孕年限、女方BMI、获卵数等因素纳入logistic回归模型进行校准。利用受试者工作特征曲线(ROC)分析不同精液参数对低受精率的预测能力。

结　　果

一、不同受精率组患者的基本情况

本研究共纳入2 647个常规IVF-ET周期，低受精率组和正常受精率组在女方年龄、男方年龄、女方BMI以及男性因素不育构成比率上的差异没有统计学意义(P>0.05)。但是，低受精率组的不育年限显著长于正常受精率组(P<0.05)(表1)。

二、不同受精率组患者的胚胎发育及妊娠结局情况

低受精率组和正常受精率组在获卵数、移植胚胎数上的差异没有统计学意义(P>0.05)。两组的平均受精率分别为28.53%和83.98%。另外，低受精率组的卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率以及临床妊娠率都显著低于正常受精率组，其差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

三、不同受精率组患者的各项精液参数情况

如表3所示，通过t检验或非参数检验，结果显示低受精率组患者的精液参数平均值都显著低于正常受精率组(P<0.05)。

四、多因素logistic回归分析

常规精液检查及优化处理后精液参数与常规IVF低受精率的关系：以受精率是否低于50%为因变量，以常规精液检查的单一精液参数(包括精子浓度、前向运动精子百分率、活动精子百分率、正常形态精子百分率)，综合精液参数(包括精子总数、前向运动精子总数、活动精子总数、正常形态前向运动精子总数)以及优化处理后的单一精液参数(精子浓度、

表1　各组患者的基本情况[(x-±s)，n(%)]

注：与正常受精率组比较，*P<0.05

表2　各组患者胚胎发育及妊娠结局情况[(x-±s)，n(%)]

注：与正常受精率组比较，#P<0.01

表3　各组患者促排卵前精液检查及取卵日优化处理后精液参数情况[(x-±s)]

注：与正常受精率组比较，*P<0.05，#P<0.01

前向运动精子百分率、活动精子百分率)，综合精液参数(包括精子总数、前向运动精子总数、活动精子总数)进行多因素logistic回归分析(表4)。用女方年龄、男方年龄、不育年限、女方BMI、获卵数校准后，结果显示常规精液检查中的正常形态精子百分率(aOR0.935；95%CI:0.898-0.974)和正常形态前向运动精子总数(aOR0.299；95%CI:0.143-0.623)，以及优化处理后的活动精子百分率(aOR0.972；95%CI:0.957-0.988)对低受精率的发生具有统计学意义，即这些精液参数的数值越小，IVF低受精率的发生概率越高(表4)。

五、ROC曲线分析精液参数对常规IVF低受精率的预测能力

如表5所示，ROC曲线分析常规精液检查中的正常形态精子百分率及正常形态前向运动精子总数，以及优化处理后的活动精子百分率对常规IVF低受精率的预测能力。结果显示，正常形态精子百分率、正常形态前向运动精子总数以及活动精子百分率的曲线下面积分别为0.604、0.636和0.636，截点值分别为7.915%、11.05×106和73.650%。相比而言，正常形态前向运动精子总数和活动精子百分率两者对常规IVF低受精率的预测价值较高。

表4　多因素logistic回归分析各项精液参数对常规IVF低受精率的影响

注：※将女方年龄、男方年龄、不育年限、女方BMI、获卵数纳入回归模型中进行校准

表5　ROC曲线分析精液参数对常规IVF低受精率的预测能力

讨　　论

精液常规分析是临床最常用的评估男性生育功能的主要检查项目，同时也是ART治疗前评估精液水平，选择ART治疗方式的依据之一。在可育人群研究中，Slama等[10]指出精液参数与成功受孕所需要的时间(简称“受孕时间”)具有一定的相关性，当精子浓度小于20×106/ml，受孕几率降低；精子浓度或正常精子形态分别在55×106/ml或39%的范围内能够影响受孕时间，但超过该值并不缩短受孕时间。然而，有研究报道获得自然妊娠的不育夫妇的男方精液参数包括精子形态和精子活力之间具有较大的差异性，并且ROC曲线分析结果指出精子形态和精子活力这些精液参数对不育夫妇自然怀孕的预测价值是有限的[11]。

ART，包括IVF和ICSI，是治疗男性因素引起不育症的主要技术。在不育夫妇行ART治疗过程中，有研究认为精液各项参数如精子形态[4，6]、精子浓度[12]以及精子活力[12-13]对IVF受精率都有影响，并对IVF结局有一定的预测作用。此外，解冻后精子活力可作为供精常规IVF临床结果的预测指标[14]。精子形态和精子活动总数对人工授精的妊娠结局也具有一定的预测价值[5，15]。但是，近几年来有研究指出单一的精液参数对IVF结局的预测具有局限性[3，16]。此外，已有文献报道精液中有效活动精子总数比单一的精子浓度、精子活力和精子形态更能反映精子质量和男性生育能力[7，17-18]。这与WHO第5版手册中多次提出的总数优先观点是一致的[19]。只是这些研究大多是通过将精液参数进行主观分组后比较其对IVF胚胎受精、发育以及临床妊娠情况，例如顾斌等[17]以及陈志恒等[9]发现优化处理后前向运动精子总数<5×106对IVF受精结局有影响。然而，我们的回顾性研究是基于以观察D1受精率低于50%则作为常规IVF患者部分卵母细胞行晚补ICSI的背景下，因此将患者分为低受精率组和正常受精率组，比较两组间各项精液参数、胚胎发育及临床结局的差异。结果显示低受精率组的各项精液参数、卵裂率、优胚率、胚胎种植率以及临床妊娠率都显著低于正常受精率组(表2，表3)。但是，需要指出的是，低受精率组和正常受精率组之间的例数相差较大，这也与低受精率组中患者数量不多有直接关系，今后的研究需要大样本的数据来支持我们的结论。后续则进行多因素logistic回归和ROC曲线分析各项精液参数与常规IVF低受精率的关系。这与Repping等[20]通过多因素logistic回归分析和ROC曲线共同分析活动精子总数对完全受精失败的预测价值的研究方法类似，但是我们没有建立不同的模型来预测低受精率的发生，这是本文的不足之处之一。从多因素logistic回归分析结果中可以看到，促排卵前常规精液检查中的正常形态精子百分率和正常形态前向运动精子总数以及取卵日优化处理后的活动精子百分率是影响常规IVF低受精率(受精率低于50%)的重要因素，表明这些精液参数对预测常规IVF低受精发生有重要意义。已有研究利用多因素logistic回归分析显示取卵日精子前向运动百分率与受精成败相关[21]，这与我们得出的结论存在不一致，但主要原因在于该研究是利用常规IVF受精率小于25%定义为受精失败来观察精液参数与受精失败的相关性。另外，该研究的样本量相对较少也可能是造成差异的原因之一。

通过多因素logistic回归分析找出影响低受精率的重要因素后，再利用ROC曲线分析这3个精液参数对常规IVF低受精率的预测价值，结果发现正常形态前向运动精子总数和活动精子百分率的曲线下面积大于正常形态精子百分率的曲线下面积(表5)，前两者的截点值分别为11.05×106和73.65%。但是，我们没有采用截点值将患者进行前瞻性分组试验以考察截点值对常规IVF低受精率的预测效果，这也是本研究的不足之处。王凤英等[8]通过相关性分析发现处理后的精子活力与受精率明显相关。蔡靖等[7]认为随着正常形态前向运动精子总数增加，IVF受精率明显增加。由此看来，我们的结果与上述研究具有一致性。值得一提的是，我们首次采用多因素logistic回归同时分析促排卵前常规精液检查以及取卵日优化处理后所有单一和综合精液参数对IVF受精率的评估能力，并且表明常规精液检查中的正常形态前向运动精子总数和优化处理后的活动精子百分率对常规IVF低受精率具有预测价值。

综上所述，男方精液参数对常规IVF受精结局具有一定的预测价值，尤其是促排卵前常规精液检查中的正常形态前向运动精子总数和优化处理后的活动精子百分率。需要指出的是本研究仅为回顾性研究，初步探讨了常规精液检查及优化处理后的精液参数对常规IVF低受精率的预测价值，但仍存在许多不足的地方，需采用前瞻性的对照实验作进一步研究，以防止常规IVF中出现低受精率的情况。

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[编辑：王慧萍]

Predictive value of semen parameters in routine semen analysis and after optimal selection in fertilization outcome of conventional IVF

SUN Qing1，2，LI Guan-gui1，2，XIONG Feng1，2，CHENG Jin-quan1，2，WAN Cai-yun1，2，PENG Yue-ting1，2，HUANG Ju1，2，ZENG Yong1，2*

1.ShenzhenKeyLaboratoryofReproductiveImmunologyforPeri-implantation，FertilityCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，Shenzhen518045 2.ShenzhenZhongshanInstituteforReproductionandGenetics，Shenzhen518045

Conventional IVF；Motile sperm；Total motile sperm count；Fertilization

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.005

2016-01-06；

2016-02-16

深圳市科创委基础研究项目(JCYJ20150402165325174)；深圳市卫计委科技计划项目(201402156)

孙青，女，浙江杭州人，博士，助理研究员，生理学专业.(*

)