现场模拟添加磷、铁及胶体对北部湾2007年春季生物固氮的影响

连忠廉，郑爱榕，黄楚光

1 国家海洋局南海分局南海环境监测中心，广州　510300　　2 厦门大学海洋学系，厦门　361005



现场模拟添加磷、铁及胶体对北部湾2007年春季生物固氮的影响

连忠廉1,2,*，郑爱榕2，黄楚光1

1 国家海洋局南海分局南海环境监测中心，广州5103002 厦门大学海洋学系，厦门361005

生物固氮是海洋氮循环的重要过程。固氮作用能够促进海洋初级生产力的提高，增强海洋吸收CO2能力，对于降低大气CO2浓度，减缓温室效应具有重要意义。2007年春季对北部湾海区进行了现场模拟添加P，Fe和胶体实验，并应用乙炔还原法(ARA，Acetylene Reducing Activity)分析其固氮速率，研究其主要影响因素。结果表明，温盐与固氮速率相关性不显著(P>0.05)。对固氮速率来说，外加P其变化范围为-97%—545%，外加Fe其变化范围为-86%—146%，外加胶体其变化范围为-96%—1456%。对叶绿素含量而言，外加P其变化范围为-24%—50%，外加Fe其变化范围为-32%—36%，外加胶体其变化范围为-53%—41%。N可能是春季北部湾海区浮游植物生长的限制因子，固氮作用主要受到P限制，而外加胶体对固氮生物和固氮速率表现出较大的促进作用。

固氮速率；ARA法；磷；铁；胶体

海洋生物固氮是海洋氮循环的重要过程[1]，为海洋生物生长提供新的氮源[2]，固氮作用能够影响海洋对大气二氧化碳的收支平衡，在一定程度上能够缓解全球气候变暖[3]。较早的研究认为束毛藻(Trichodesmium)是海洋中唯一光合自养型固氮生物[4]。近年来分子微生物技术的研究表明其它含有固氮基因(nifH)的微生物也具有固氮能力[5]。因此，固氮生物的固氮能力可能远比此前研究所揭示的大得多[6]。

尽管海洋固氮生物有巨大的固氮潜力，其固氮速率却受到各种物理和化学因子的限制，使得固氮生物的固氮总量不可能无限增加。其中，温度与盐度等环境因子可能会影响海洋中固氮生物的生长和固氮速率[7-8]。而长期以来，有关海洋环境中生物固氮影响因素的争论主要集中在P、Fe等限制性营养盐上[9-12]。Tyrrell[13]等的研究结果表明，海洋中贫营养的上层水体N被大量消耗，而海水中仍有少量的P存在，P被认为是在地质年代学上对固氮作用起限制作用的元素。而Walve[14]等研究表明在一定条件下P、N对生物固氮表现为共同限制作用。铁是一种重要的微量营养元素，限制了高氮低生产力海区浮游植物的生长[9]。因其为固氮酶的重要组成成分，少量Fe也能够对固氮作用起限制作用[11]。与N，P类似，Fe，P对固氮作用也会表现为共同限制作用[4]。此外，胶体广泛存在于海洋中，其作为营养盐，痕量金属，营养性有机碳，痕量有机物等物质重要载体，对许多浮游植物生产具有促进作用，同样胶体也会对固氮生物产生影响[15]。基于海洋环境的复杂性，目前国内对海洋生物固氮的环境影响因素和海洋生物固氮规律的了解甚少，仅见张燕英[16]等在实验室培养条件下研究了盐度、昼夜变化、温度及阿特拉津对2 种海洋固氮蓝藻固氮活性的影响。关于P、Fe对生物固氮的研究较多，但对于其影响的机制仍不清楚，而胶体对生物固氮的影响较少，亟待深入研究[15]。因此，探讨P、Fe和胶体等物理化学因子对海洋生物固氮的影响，解释海水营养环境变化对生物固氮的影响机制具有重要意义。

本研究选择北部湾海域为研究对象。北部湾湾内的温度、盐度等要素受到陆地和河流因素的影响。此外，P和Fe等营养元素也受到各河流和大气沉降的共同作用，还有湾中水体胶体含量丰富。因此，通过现场模拟添加实验研究P、Fe和胶体对春季北部湾生物固氮速率的影响，来探究其固氮作用对各营养环境的响应，为评估物理化学因素对生物固氮的影响提供依据。

1　实验材料与方法

1.1样品采集

图1　中国北部湾采样站位Fig.1　Sampling sites in Beibu Gulf of China

2007年4—5月中国科学院南海海洋研究所春季航次(“实验二号”考察船)期间，共采集9个表层水样，由北到南依次为C01、C02、C03、C04、C05、C06、C07、C08、C09(采样站位见图1，经纬度见表1)。

1.2方法

1.2.1温度盐度的测定

采样站位的温度和盐度由CTD(Conductance Temperature Depth，型号为Sea-Bird 911Plus) 现场测量获得，温度、电导率的测量精度分别为±0.004℃和±0.003s/m。

1.2.2营养盐的测定

到达指定站位后，用CTD Niskin采水器采集一定体积的表层海水，0.45 μm醋酸滤膜过滤水样，然后用船载723OG分光光度计分析各营养盐浓度。营养盐和叶绿素的测定方法严格按照《海洋监测规范第4部分：海水分析》(GB 17378.4—2007)进行。

1.2.3现场模拟添加实验

设置P(磷酸二氢钠)的浓度梯度为C，C+0.08，C+0.16，C+0.32，C+0.48 μmol/L，Fe(FeCl3)的浓度梯度为C，C+0.22，C+0.44，C+0.88，C+1.32 μmol/L，C为水样中原有营养盐的浓度，胶体(粒径介于0.22 μm和10 kDa)的现场制备过程见陈丁等[17]，并设0，2%，50%，100% 4个胶体百分比浓度。根据距离湾口的远近，随机选取C02、C05、C07、和C09站位进行模拟添加实验。由于具有操作简便、高灵敏度、较快的分析速度以及较低的耗资等优点，采用乙炔还原法(ARA，Acetylene Reducing Activity)测定固氮速率[18]。分别量取250 mL，1 L混合均匀的表层海水于300 mL盐水瓶和1.5 L培养瓶中，在两瓶中按照设定的营养盐或胶体百分比浓度分别进行添加实验，同时做平行样。用含硅胶垫的橡皮塞密封盐水瓶口，同时盖上1.5 L的培养瓶，用气体进样针从气袋里抽取5.00 mL纯乙炔气体，注入密闭盐水瓶的上层空气中(培养瓶中不添加乙炔)，并上下摇晃使气液混合达到平衡，将上述盐水瓶和培养瓶放入已准备好的现场流动水培养箱进行培养，培养时间为12 h。经培养后的盐水瓶，用5.00 mL气体进样针抽取瓶内的气体，转入到气相色谱专用气体顶空瓶内保存，用封口膜密封顶空瓶塞。

顶空瓶倒置放在阴凉避光处保存，带回实验室进行气体分析。往培养后的1.5 L培养瓶内加入两滴1%碳酸镁溶液，水样经47 mm Whatman GF/F玻璃纤维膜过滤后，将所得微孔滤膜用锡箔包好，并冷冻保存，带回实验室测定叶绿素含量。叶绿素含量作为浮游植物的生长指标。

1.2.4固氮速率的测定

用GC900型气相色谱仪(上海科创仪器厂)对顶空气体进行分析，并按下式计算样品的固氮速率：

式中，V为固氮速率(μg N L-1h-1)，C总为乙烯的总含量(μmol/mol)，V气为现场培养下气相的体积(本实验为50 mL)，V液为现场培养下液相的体积(本实验为250 mL)，M为N2的摩尔质量(28 g/mol)，n为C2H2∶N2的换算因子(设n=4)[7]，t为现场培养时间(t=12 h)。

1.3数据处理

本研究采用相对固氮速率和相对叶绿素含量来说明加富对生物固氮速率以及叶绿素含量的影响。其中，相对固氮速率=(实验组的乙烯含量-对照组乙烯含量)/对照组乙烯含量×100%，相对叶绿素含量=(实验组的叶绿素含量-对照组叶绿素含量)/对照组叶绿素含量×100%。实验所有数据都通过软件SPSS 17.0处理。

2　结果与讨论

2.1春季北部湾表层水体固氮速率的影响因素分析

9个调查站位的固氮速率见表1。由表1可知，不同站位有不同的固氮速率，温度、盐度与其相关性不显著(R<0.3，P>0.05)。固氮速率平均值为2202.24 pmolN L-1h-1，最高值出现在C06站位，最低值出现在C04 站位，最高值是最低值的28.7倍。调查过程中观察到C06站位海面风平浪静，水体呈现微红色，而该站位溶解态无机磷(DIP，Dissolved inorganic phosphorus)的浓度极低(表2)，将表层水样生物固定以后，带回实验室显微观察发现有大量的束毛藻存在。束毛藻是贫营养热带和亚热带海区最主要的固氮生物，是一种重要的赤潮生物[19]。可以推断，C06站位发生“水华”，束毛藻大量繁殖，因而有极高的固氮速率。同时，由表1和表3可以看出，因北部湾营养盐含量相对较高，其固氮速率小于北太洋等寡营养盐海域，这与C06的观测结果相一致。

表1　春季北部湾表层水体固氮速率的积分值

表2　北部湾春季表层水体营养盐相关数据

-：未检出；/表示未测定；DIN：溶解态无机氮 Dissolved inorganic nitrogen；DN：溶解态氮 Dissolved nitrogen；TN：总氮Total nitrogen；DIP：溶解态无机磷 Dissolved inorganic phosphorus；DP：溶解态磷 Dissolved phosphorus；TP：总磷 Total phosphorus

此外，由表2观测数据对固氮速率与营养盐相关性进行统计分析，固氮速率与溶解态无机氮(DIN)与DIP比值的相关关系非常弱(R=0.219，P=0.677)，与总氮(TN)与总磷(TP)比值表现出弱的负相关(R=-0.103，P=0.846)，而与溶解态氮(DN)与溶解态磷(DP)的相关关系最强(R=0.950，P=0.013)，且氮磷比越高，固氮速率越高。这与Karuk[20]等研究结果具有较高固氮速率的海域也具有较高氮磷比相一致，说明固氮生物可以利用溶解态氮磷(有机氮磷和无机氮磷)。同样的，在C06和C07站检测的固氮速率远高于其他站位，相应的DIP含量为未检出，而DP的含量也相对较低，由此可以推断出生物固氮过程中需要消耗大量的DP，DP是其固氮速率的限制因子[1]。而已有现场测定束毛藻的溶解态有机磷(DOP)吸收值相当高，为(170—300)nmol Chl-a-1h-1，也说明DOP是束毛藻磷的主要供应者[21]。

表3　各海域固氮速率的概述

*ARA为乙炔还原法，除本研究的C2H2∶N2分配比为4∶1，其他C2H2∶N2分配比为3∶1；15N：15N同位素测定法

2.2对叶绿素含量和固氮速率的影响分析

2.2.1外加P对叶绿素含量和固氮速率的影响

图2　春季外加P对生物固氮速率和叶绿素含量的影响　Fig.2　Effect of N2 fixation rates and chlorophyll by P addition in spring0.08-N，0.08-C分别表示添加浓度为0.08μmol/L条件下的相对固氮速率和相对叶绿素含量

由图2可知，外加不同浓度的P对固氮速率的影响不同，表现为抑制或促进作用。外加0.08 μmol/L的磷酸二氢钠，除了C09站位以外，其它3个站位都起到促进固氮速率的作用，相对固氮速率变化范围为-92%—242%(P<0.05)。外加其它浓度的磷酸二氢钠对固氮速率的影响则较为复杂。不同站位受到P添加的影响也不同：外加P对C02，C09站位表现为较明显的促进作用(P<0.05)，最大促进作用为545%。而C05站位除了低浓度促进固氮速率之外，较高浓度的P对固氮速率都表现为明显的抑制作用(P<0.05)，最大抑制作用为-97%。外加P对固氮速率的抑制作用不明显(P>0.05)，能够较多地促进固氮生物的固氮作用，进一步证明了春季北部湾海区固氮作用受到P限制。

与外加P对固氮速率的影响不同，P添加对叶绿素含量的影响程度相对较低。高浓度的P对叶绿素含量表现为明显的抑制作用，最大抑制作用为-12%。但在C05站位，外加P对叶绿素含量表现出较高的生长情况，尤其是添加高浓度的P，相对叶绿素含量上升了近50%，另外，在C05站位添加P对固氮速率更多地表现为抑制作用。可见，外加磷对叶绿素含量和固氮速率变化不存在一致性，这可能说明浮游植物的生长有时并不伴随着固氮生物的增加，或者说其他浮游植物的增加大于固氮类生物的增加以及浮游动物的摄食等因素影响，从而降低了其固氮速率。

2.2.2外加Fe对叶绿素含量和固氮速率的影响

由见图3可知，外加Fe对固氮速率的影响不明显(P>0.05)，且较多表现为抑制作用，这与外加P的影响相反，最大抑制作用为-86%，最大促进作用为146%。这可能与北部湾大气沉降输入较高的Fe有关，使外加Fe并不能较大地促进固氮生物生产，从而表现出部分抑制作用。

与外加P作用相比，外加Fe对叶绿素的含量有一定的促进作用，上升的相对叶绿素含量都在40%以下，变化范围为-32%—36%。Fe是一种固氮微生物的速率限制性营养盐，可能会限制贫营养海区固氮生物的固氮速率[26]。北部湾有高的大气沉降作用，能够向表层海水提供较多的Fe。因此，水体中的Fe并不是浮游植物生长限制因素，外添加的Fe导致水体中含量过高抑制了浮游植物的固氮能力，降低其固氮速率。

2.2.3外加胶体对叶绿素含量和固氮速率的影响

由图4可知，外加胶体对固氮速率的促进作用明显(P<0.05)，除了C09站位，其余3个站位都显示出较高的固氮速率上升，尤其是在C07站位，当添加胶体浓度百分比为2%时，相对固氮速率达1459.3%；C09站位的固氮速率仅表现出轻微的下降。胶体具有极强的络和能力，是营养盐，痕量金属，营养性有机碳，痕量有机物等物质的重要载体[27]。固氮作用需要各种营养要素的综合作用，适当的胶体浓度能够极大地提高固氮速率。

图3　春季外加铁对生物固氮速率的影响Fig.3　Effect of N2 fixation rates by iron addition in spring　0.08-N，0.08-C分别表示添加浓度为0.08μmol/L条件下的相对固氮速率和相对叶绿素含量

图4　春季外加胶体对生物固氮速率的影响 Fig.4　Effect of N2 fixation rates by colloid addition in spring2%-N，2%-C分别表示在添加胶体比例为2%条件下的相对固氮速率和相对叶绿素含量

几乎所有添加胶体的实验组叶绿素含量都增加，仅C09站表现出抑制作用，叶绿素含量变化范围为-53%—41%，而且不同浓度的胶体之间差异不显著(P>0.05)，可能是因为胶体在不同的浓度下所产生的效应是一致的，能为水体提供一种动态平衡作用。

2.3不同现场添加实验对叶绿素含量和固氮速率的影响比较

本研究表明，外加P对固氮速率的促进作用高于外加Fe的促进作用，外加P的最大相对固氮速率是添加Fe的最大相对固氮速率的3.7倍。已有研究表明固氮生物对P的需求是Fe的30—300倍[4]，而北部湾海区又处于较明显的P限制状态，因此，外加P能够较明显地促进固氮速率。MILLS[4]等对北大西洋东部海区的研究结果表明，P、Fe是固氮生物固氮作用了共同限制因子。而本研究得出P可能是北部湾海区固氮作用的限制因子，北部湾海区的生物固氮主要受P的限制作用。

此外，P、Fe对叶绿素的促进作用不明显，相关性分析表明，浮游植物的生产力与固氮生物的固氮速率没有显著的相关关系。群落的初级生产力受到N限制，而固氮作用则受到Fe-P的共同限制[4]。Wu[10]等的研究结果也表明，N限制了浮游植物的生长，而固氮作用可能受到Fe的限制。 因此，北部湾海区浮游植物的生长可能受到N限制的作用，固氮作用主要受到P的限制作用。

胶体能够将水体中营养物质和痕量金属物质进行络合，促进浮游植物的固氮作用。所以，外加胶体后固氮作用上升显著。另外，Bauer[28]等对几个大洋的C、N成分的进行研究表明，胶体有机部分的N比较缺乏，C/N比值为20—22，而低分子有机物的N含量较高，然而C/N比值为也只有2—5。在外加胶体后，浮游植物有一定的生长但生长不显著，这也进一步证明了北部湾海水胶体中N可能是浮游植物生长的限制因素。对比最大促进作用是胶体，其次为P，Fe最小，在北部湾表层水体中对浮游植物，这可能和胶体本身含有大量的营养盐和天然络合物有关。

3　结论

北部湾春季表层海水不同站位因营养盐含量不同其固氮速率而存在差异，温盐对固氮速率的影响较小。春季北部湾水体中高的固氮速率对应着较高的DN/DP，说明固氮生物在固氮过程中需要消耗大量溶解态磷。北部湾春季固氮速率较寡营养盐海域低，可能同北部湾具有较高的营养盐含量有关。

同时外加P、Fe和胶体现场模拟实验结果表明，单独进行的Fe或P的添加对固氮生物固氮速率的促进作用远小于胶体的促进作用。此外，浮游植物生长与固氮速率之间没有显著的相关关系，北部湾春季浮游植物的生长可能受N限制，固氮作用则主要受P的限制。可以看出，受到营养盐的限制的北部湾固氮作用，将影响到北部湾氮源以及氮的生物地球化学过程。

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Factors that affected nitrogen fixation by the addition of phosphorus, iron, and colloids in the surface water of the Beibu Gulf in spring, 2007

LIAN Zhonglian1,2,*，ZHENG Airong2, HUANG Chuguang1

1SouthChinaSeaBranch,StateOceanicAdministration,Guangzhou510300,China2DepartmentofOceanography,CollegeofOceanandEarthSciences,XiamenUniversity,Xiamen361005,China

Nitrogen fixation is an important process in marine nitrogen recycling. It can enhance marine primary productivity and marine carbon fixation capacity and reduce CO2concentration in the atmosphere, thus mitigating the greenhouse effect. The Beibu Gulf is a semi-enclosed bay located northwest of the South China Sea. In the Beibu Gulf, P and Fe are influenced by river input and atmospheric deposition, and the water in Beibu Gulf is rich in colloids. In order to study the effects of P, Fe, and colloids on the nitrogen fixation rate and nitrogen fixation in response to the nutritional environment, we conducted a field addition experiment for P, Fe, and colloid simulation in the spring of 2007. Surface water samples were collected from nine study sites between April and May 2007. P, Fe, and colloids were separately added for a scene simulation in the study sites of C02, C05, C07, and C09. Concentration gradients of P (potassium dihydrogen phosphate) were set as C, C+0.08, C+0.16, C+0.32, and C+0.48 μmol/L. Concentration gradients of Fe were set as C, C+0.22, C+0.44, C+0.88, and C+1.32 μmol/L (C is the concentration of nutrients in in situ water samples). Concentration gradients of colloids (particle size, between 0.22 μm and 10 kDa) were set as 0%, 2%, 50%, and 100%. The acetylene-reducing activity method was used to study nitrogen fixation and factors that affect it. The results showed that the contributions of temperature and salinity to the nitrogen fixation rate were low, while P, Fe, and colloids increased the nitrogen fixation rate. The nitrogen fixation rate was greatly promoted by adding colloids, while the addition of P and Fe did not affect the nitrogen fixation rate to a great extent. However, variations in the nitrogen fixation rate due to the addition of P, Fe, and colloids were -97% to 545%, -86% to 146%, and -96% to 1456%, respectively, and variations in chlorophyll contents were -24% to 50%, -32% to 36%, -53% to 41%, respectively. Differences in the nitrogen fixation rate were due to different nutrient concentrations in the surface water of the study sites in the spring of the Beibu Gulf. The nitrogen fixation rate was strongly related to dissolved nitrogen/dissolved phosphorus (DP), which indicated that a large amount of DP was consumed by organisms that perform nitrogen fixation. The high nutrient content in the Beibu Gulf may be the reason why the nitrogen fixation rate in the Beibu Gulf was lower than that in the oligotrophic sea. Moreover, there was no significant correlation between the rate of phytoplankton growth and nitrogen fixation rate. Phytoplankton growth limited the amount of nitrogen, and nitrogen fixation limited the amount of phosphorus. Effects of nitrogen fixation, which was limited by nutrients in the Beibu Gulf, could have a great influence on nitrogen sources and nitrogen biogeochemical processes. The results suggest that nitrogen may be a limiting factor for marine primary productivity in the spring in the Beibu Gulf, phosphorus is a limiting factor for the nitrogen fixation rate, and the addition of colloids enhances the nitrogen fixation rate.

N2fixation; ARA method; phosphorus; iron; colloids

国家自然科学基金重大研究计划重点项目 (90411016)

2014-11-24; 网络出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: lianzhonglian@aliyun.com

10.5846/stxb201411242327

连忠廉，郑爱榕，黄楚光.现场模拟添加磷、铁及胶体对北部湾2007年春季生物固氮的影响.生态学报,2016,36(14):4355-4362.

Lian Z L，Zheng A R, Huang C G.Factors that affected nitrogen fixation by the addition of phosphorus, iron, and colloids in the surface water of the Beibu Gulf in spring, 2007.Acta Ecologica Sinica,2016,36(14):4355-4362.