阿司匹林对食管鳞癌细胞系Eca-109癌干细胞的抑制作用

陈云云，宁志丰，白育庭

(1.武汉大学中南医院胸心外科，湖北 武汉 430071；2.湖北科技学院基础医学院人体解剖学教研室；3.湖北科技学院)



阿司匹林对食管鳞癌细胞系Eca-109癌干细胞的抑制作用

陈云云1，宁志丰2，白育庭3*

(1.武汉大学中南医院胸心外科，湖北 武汉 430071；2.湖北科技学院基础医学院人体解剖学教研室；3.湖北科技学院)

目的 探讨阿司匹林对于食管鳞癌干细胞有无抑制作用。方法 对人食管鳞癌细胞系Eca-109进行培养，用悬浮培养法获得食管鳞癌干细胞，观察阿司匹林对于食管鳞癌细胞微球体形成能力的影响，平板克隆观察阿司匹林对食管鳞癌干细胞克隆形成的影响，MTT实验观察阿司匹林对食管鳞癌干细胞增殖的影响，Transwell小室实验观察阿司匹林对食管鳞癌干细胞迁移侵袭能力的影响。结果 阿司匹林能够显著影响微球体的形成，抑制食管鳞癌干细胞克隆形成、增殖和迁移侵袭能力。结论 阿司匹林能够有效抑制食管鳞癌干细胞的自我更新、克隆增殖、迁移侵袭能力，并呈现剂量依赖关系。

阿司匹林；食管鳞状细胞癌；肿瘤干细胞

食管鳞癌是消化系统的常见恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织2015年的资料，2012年全球因癌症导致的死亡人数为820万，而由食管鳞癌致死的人数为40万，位列癌症致死的第六位。食管鳞癌在世界范围内存在着地区、种族、病理类型的差异[1]。有资料表明[2～5]:长期服用阿司匹林能够降低患食管鳞癌的风险，减少食管鳞癌的复发。但是目前尚未有确切的细胞学和动物实验证实阿司匹林能够有效的抑制食管鳞癌干细胞。本研究以食管鳞癌Eca-109细胞为研究对象，探讨阿司匹林对Eca-109细胞癌干细胞的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料食管鳞癌细胞系Eca-109购自中国典藏物培养中心，RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Hyclone公司，双抗为天津索罗门公司产品，Transwell小室为Costar公司产品，低黏附6孔板购自Corning公司，Matrigel 为BD公司产品，表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子bFGF、神经生长因子B27购自Peprotech公司，阿司匹林、二甲基亚砜(DMSO)购自SIGMA公司。其他试剂为生化分析纯。

1.2Eca-109细胞的培养将Eca-109细胞在普通完全培养基于37℃、5%CO2培养箱内培养，待培养约48h后换液1次；待贴壁细胞铺满培养瓶约80%时，以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，机械吹打分离，离心重悬后以1∶2比例传代。普通完全培养基成分为：10%的FBS、90%RPMI-1640、1%的青霉素链霉素双抗。

1.3药物的配制称取1800mg阿司匹林溶于2.5mL DMSO，制成4 mol/L的阿司匹林原液，按照实验要求用培养基稀释成实验所需的浓度梯度：0、2.5、5 mmol/L。

1.4微球体的形成

1.4.1Eca-109细胞的成球培养取处于对数生长期的Eca-109细胞，消化离心、计数、悬浮培养基重悬、离心后再重悬，取10000个细胞接种于Poly-hema包被的25cm2培养瓶，于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱内培养。隔天补充2mL悬浮培养基，于培养9～10d取微球体传代。悬浮培养基的成分为：无血清DMEM/F12(1∶1)中添加2%B27、20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF。

1.4.2阿司匹林对Eca-109细胞微球体形成影响取处于对数生长期的Eca-109细胞，消化离心，悬浮培养基重悬，500个/孔接种于低黏附6孔板(Corning公司)悬浮培养，调整每孔阿司匹林浓度为0、2.5、5mmol/L，每隔3d半量换液，培养9～10d后结束培养，镜下观察直径大于75μm的微球体为阳性微球体，计算阳性微球体的形成率，微球体形成率=阳性微球体数/每孔接种细胞数。

1.5平板克隆取悬浮培养的微球体，离心，消化，机械吹打分离，细胞计数，普通完全培养基重悬，500个/孔接种于6孔板，24h后常规换液，加入阿司匹林浓度分别为0、2.5、5mmol/L的完全普通培养基，每隔3d常规换液，培养7～14d后，待肉眼可见克隆后终止培养，吸去培养基，2mL PBS洗2遍，加入甲醇室温固定30min，结晶紫染色30min，PBS冲洗，计数克隆数，计算克隆率，克隆率=克隆数/接种细胞数。

1.6MTT实验取悬浮培养的微球体，离心、消化、机械吹打分离、细胞计数，普通培养基重悬，10000个每孔接种于96孔板分别调整阿司匹林浓度为0、2.5、5mmol/L，定容至200μL，每个浓度设4个复孔，并设置空白对照(加入PBS)和凋零孔(只加入普通完全培养基)，于培养终止前4h每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，终止培养，吸去废液，每孔加入150μL DMSO震荡至结晶完全溶解，于490 nm测出每孔OD值。连续监测培养24、48、72h。

1.7Transwell小室迁移实验取悬浮培养的微球体，离心、消化、机械吹打分离、细胞计数、无血清培养基重悬，每室加入10000个细胞，并调整上室最终体积为200μL，阿司匹林浓度分别为0、2.5、5mmol/L。下室加入600μL普通完全培养基。分别设置阴性对照(下室加入无血清培养基)，每个浓度设置3个复孔，于37℃、5%CO2培养箱内培养24h。取出小室，PBS洗2遍，甲醇室温固定30min，结晶紫染色30min，除去小室上层未迁移细胞，高倍镜下计数上中下左右5个视野的迁移细胞数，计算平均数。

1.8Transwell小室侵袭实验将冻存于-80℃冰箱的BD matrgel基质胶取出，4℃过夜，待其变成液态后与无血清培养基按1∶5比例混匀，每个小室加入100μL，放入37℃培养箱内孵育4～5h待其凝固待用，使用前用无血清培养基湿润。

取悬浮培养的微球体，离心，消化，机械吹打分离，无血清培养基重悬，细胞计数，每室加入20000个细胞，并调整上室最终体积为100μL，阿司匹林浓度分别为0、2.5、5mmol/L。下室加入600μL普通完全培养基。分别设置阴性对照(下室加入无血清培养基)每个浓度设置3个复孔，于37℃、5%CO2培养箱内培养48h。取出小室，PBS洗2遍，甲醇室温固定30min，结晶紫染色30min，除去小室上层细胞，高倍镜下计数上中下左右5个视野的迁移细胞数，计算平均数。

2　结　果

2.1阿司匹林抑制微球体的形成微球体形成实验显示：相对于对照组(阿司匹林浓度0 mmol/L)阿司匹林各处理组(阿司匹林浓度2.5、5 mmol/L)微球体体积变小,数量变少。各组的成球率分别为(9.6±0.82)%、(7.1±0.56)%、(5.7±0.56)%，差异有统计学意义(P=0.0000)。阿司匹林抑制微球体的形成且随着阿司匹林浓度增加呈现量效关系。见图1(封二)。

2.2阿司匹林抑制微球体细胞克隆形成阿司匹林各处理组(阿司匹林浓度0、2.5、5mmol/L)克隆率分别为:(69.2±6.1)%、(54.2±3.9)%、(21.0±2.3)%，差异有统计学意义(P=0.0000)。阿司匹林能抑制微球体细胞克隆形成，并随着阿司匹林浓度增加呈现量效关系。见图2(封二)。

2.3阿司匹林抑制微球体细胞的增殖阿司匹林各处理组(阿司匹林浓度0、2.5、5mmol/L)各个时间段的OD值见图3，差异有统计学意义(P=0.0000)，阿司匹林能抑制微球体细胞的增殖能力，并随剂量和时间的增加呈现出量效时效关系。

图3　不同时间段与不同浓度阿司匹林对微球体细胞增殖的影响(n=4)

2.4Transwell小室迁移实验阿司匹林能抑制微球体细胞的迁移能力：阿司匹林各处理组(阿司匹林浓度0、2.5、5mmol/L)的迁移细胞数分别为(129±12.1)、(83±10.8)、(41.3±3.5)，差异有统计学意义(P=0.0000)。阿司匹林能够抑制微球体细胞的迁移能力且随着阿司匹林浓度增加呈现量效关系。见图4(封二)。

2.5Transwell小室侵袭实验阿司匹林能抑制微球体细胞的侵袭能力：阿司匹林各处理组(阿司匹林浓度0、2.5、5mmol/L)的侵袭细胞数分别为(105.3±8.0)、(67.7±4.5)、(36.3±6.7)，差异有统计学意义(P=0.0000)，阿司匹林能够抑制微球体细胞的侵袭能力且随着阿司匹林浓度增加呈现量效关系。见图5(封二)。

3　讨　论

随着生活水平的提高，癌症成为仅次于心血管疾病威胁人类健康的的第二大杀手，每年癌症的发病率和死亡率逐年上升。传统肿瘤理论认为：肿瘤组织中所有的肿瘤细胞具有均一性，都具有无限增殖能力。传统的肿瘤治疗手段主要是手术切除、放疗和化疗，但对于中晚期肿瘤、转移肿瘤和复发肿瘤疗效不佳。Mackillop等[6]认为在所有的肿瘤组织中存在着很少一部分细胞，它们具有类似干细胞的功能，决定着肿瘤细胞的生长、增殖、分化，与肿瘤的复发、转移密切相关。Bonnet等[7]研究者在研究急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)时发现：细胞表面抗原CD33+/CD88-的AML细胞可能为AML干细胞。随后，在越来越多的肿瘤中发现了肿瘤干细胞。越来越多的研究者意识到：靶向根除肿瘤干细胞，可能是治愈肿瘤的关键。

然而，要研究肿瘤干细胞，首先要解决的是肿瘤干细胞分离、纯化的问题，因为肿瘤干细胞只在肿瘤细胞中占据很少一部分。目前，肿瘤干细胞的分选方法包括侧群(side population)细胞法，也有利用肿瘤干细胞表面特异性的抗原与单克隆抗体结合，再用特定的方法将与单抗结合的肿瘤干细胞分离出来的表面标志分选法。根据单克隆抗体标记物的不同又分为有荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)和磁性激活细胞分选(magnetic activated cell sorting，MACS)。也有研究者利用肿瘤干细胞在添加了生长因子的无血清培养基中，悬浮生长，自我更新而形成致密球状，保持不分化状态；而非干细胞则贴壁生长，且在无血清条件下停止生长，经过长时间的培养最终死亡。这种方法称为无血清培养基(serun-free medium)分选法(又称悬浮培养法)。Hemmati等[8]和Singh等[9]在添加了神经生长因子B27(1∶50)、表皮生长因子EGF(20 ng/mL)、成纤维细胞生长因子bFGF(10 ng/mL)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养基中成功培养出了细胞球，随后证实细胞球细胞为神经胶质瘤干细胞。

本研究采用无血清培养基分选法分离食管鳞癌细胞系Eca-109肿瘤干细胞，相比其他的肿瘤干细胞分选方法，悬浮培养法具有以下优点：避免了SP法DNA染料Hoechst 33342的细胞毒性和分选效率低的问题；不需要昂贵的设备和复杂的操作，操作简单，可以大量获得肿瘤干细胞。本研究成功的用Eca-109细胞培养出了微球体，微球体呈不规则的团状，细胞连接紧密，边缘透光性好。关于微球体细胞是否为食管鳞癌干细胞，宁志丰等[10]详细的从微球体细胞的克隆形成、增殖能力、迁移侵袭能力、耐药性方面鉴定其干细胞特性。与Li等[11]、崔翔等[12]、黄燕燕等[13]的报道一致。

阿司匹林老药新用作为抗肿瘤药物，有研究发现阿司匹林对肿瘤干细胞有抑制作用。Maity等[14]研究发现，阿司匹林可以抑制乳腺癌干细胞的自我更新、克隆增殖能力，可以抑制上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)这一过程，阿司匹林可以通过抑制TGF-β/SMAD4 信号通路来实现上述调节。Zhang等[15]细胞实验发现阿司匹林可以抑制胰腺癌干细胞的自我更新、克隆增殖并可有效改善吉西他滨治疗胰腺癌时的耐药问题，延长体外致瘤的时间，显著减小成瘤体积。Moon等[16]的研究显示：阿司匹林及其前体药物可以抑制COX-2/PTGS2和NOTCH/HES1信号通路，激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ(γ-PPAR)，因而可以显著改善5-氟尿嘧啶治疗的耐药问题，以有效抑制结肠癌干细胞，抑制其干细胞标志的表达及其自我更新能力。本研究结果显示，阿司匹林能够有效的抑制食管鳞癌Eca-109癌干细胞的自我更新能力、克隆增殖能力、迁移侵袭能力，并呈量效关系。与上述实验的结果一致。

因此，我们可以得出结论：阿司匹林能够抑制食管鳞癌干细胞的自我更新、克隆增殖、迁移侵袭能力。

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Effects of Aspirin on Cancer Stem Cells of Esophageal Squamous Cell Carcinoma

CHEN Yun-yun,NING Zhi-Feng,BAI Yu-ting

(DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,ZhongnanHospital,WuhanUniversity,WuhanHubei430071,China)

Objective To investigate the effects of different levels of aspirin on cancer stem cells of esophageal squamous cell carcinoma.Methods The esophageal carcinoma cell lines Eca-109 was cultured in suspension medium to generate microspheres.The effect of different levels of aspirin on microsphere formation was explored.Plate clony formation was used to evaluate the effect of different levels of aspirin on clony forming ability of microsphere cells.MTT assay was used to explore the effect of different levels of aspirin on proliferation of microsphere cells.Transwell chamber assay was used to explore the effect of different levels of aspirin on migration and invasion of microsphere cells.Results Aspirin inhibited the formation of microspheres，and inhibited proliferation,migration and invation of microsphere cells.Conclusion Aspirin can inhibit self-renew,clony formation,proliferation，migration and invation of esophageal cancer stem cells.

Aspirin;Esophageal squamous cell cancer;Cancer stem cell

，E-mail：xybyt0628@163.com

R735.1

A

2095-4646(2016)04-0280-04

10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.04.0280

2016-03-30)