烟草铁蛋白基因NtFer1对粳稻遗传转化及其基因功能研究

唐鑫华，姜廷波，高红秀，王敬国，邹德堂*（.东北农业大学农学院，哈尔滨　50030；.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨　50040）

烟草铁蛋白基因NtFer1对粳稻遗传转化及其基因功能研究

唐鑫华1，姜廷波2，高红秀1，王敬国1，邹德堂1*
（1.东北农业大学农学院，哈尔滨150030；2.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨150040）

利用农杆菌介导法将烟草铁蛋白基因NtFer1转入粳稻，经抗性筛选、PCR、Southern杂交、Northern杂交检测。结果表明，外源基因已整合到粳稻基因组中，并能稳定遗传表达。过量Fe2+营养液条件下培育自交T1代植株，研究表明转基因株系SOD和POD活性、叶绿素相对含量高于对照，而MDA含量则相反；转基因株系叶片和糙米总铁含量高于对照，所测16种氨基酸总含量与对照无显著差异，但部分氨基酸含量存在差异；接种稻瘟病混合小种菌液转基因株系稻瘟病叶瘟指数低于对照。烟草铁蛋白基因NtFer1转入表达可提高粳稻叶片和糙米储藏铁离子能力，增强对高铁胁迫耐性和稻瘟病叶瘟抗性。

NtFer1；总铁含量；粳稻；稻瘟病

唐鑫华,姜廷波,高红秀,等.烟草铁蛋白基因NtFer1对粳稻遗传转化及其基因功能研究[J].东北农业大学学报,2016,47(4): 73-78.

Tang Xinhua,Jiang Tingbo,Gao Hongxiu,et al.Research on gene function and japonica genetic transformation of tobacco ferritin geneNtFer1[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(4):73-78.(in Chinese with English abstract)

网络出版时间2016-4-22 10:01:19[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1001.020.html

铁是植物生长必需微量元素之一，在植物叶绿体合成和酶组成中必不可少，能促进植物光合及呼吸作用[1]；是动物体血红蛋白重要组成元素之一，铁摄入量不足易导致贫血等疾病。酸性条件下土壤会释放大量Fe2+，造成铁污染，而过量Fe2+将催化Fenton反应，生成具有强氧化性羟自由基，对植物产生毒害，潜育性水稻土中Fe2+毒害是限制水稻生长原因之一[2-3]。铁蛋白（Ferritin）是一种可储存铁离子的储藏结合蛋白，由24个同源或异源亚基组成的450 ku复合体，每个铁蛋白分子可储藏0～4 500个可溶、无毒、可利用铁离子；可为植物体光合作物和固氮铁源，作为胁迫反应蛋白，促进过剩铁离子储藏[4-6]。

研究表明，烟草铁蛋白基因NtFer1在烟草中过量表达能提高植株抗氧化能力、叶片总铁含量和最大光化学量子产量[7]。将豌豆铁蛋白基因转入水稻，转基因植株叶片与非转基因植株相比对氧化胁迫耐受能力有不同程度增强[8]；将紫花苜蓿铁蛋白基因转入烟草，转基因烟草对除草剂百草枯引起的氧化胁迫抗性增强[9]。将豌豆铁蛋白基因转入粳稻（秀水11），转基因植株铁贮藏量增加、体内游离铁含量降低，减轻植株氧化损伤[10]。本研究将铁蛋白基因NtFer1转入粳稻（东农427），过量Fe2+胁迫条件下分析转基因粳稻生理响应、总铁含量和糙米氨基酸含量等，为深入研究铁蛋白基因功能、防止土壤中过量Fe2+对水稻毒害及作物抗逆基因工程研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

试验选用粳稻品种东农427，由东北农业大学水稻研究所提供。烟草铁蛋白基因NtFer1（Gen⁃Bank登录号：AB083924）为前期研究获得，cDNA编码区全长756 bp，编码251个氨基酸。植物表达载体PBI121由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供。

1.2方法

1.2.1载体构建和菌株培养

将烟草铁蛋白基因NtFer1 cDNA片段插入植物表达载体PBI121替代GUS基因，启动子CaMV 35S，终止子NOS，筛选标记NPTⅡ基因，利用冻融法将经测序质粒导入农杆菌EHA105。将农杆菌EHA105-NtFer1涂布含Kan 50mg·L-1和Rif 50mg· L-1的LB固体培养基，27℃暗培养，挑取若干单菌斑至含Kan 50mg·L-1和Rif 50mg·L-1的LB液体培养基，27℃、160 r·min-1培养12～16 h，取500 μL上述菌液加入100mL YEB培养液中，待OD= 0.5时侵染备用。

1.2.2农杆菌介导法遗传转化

粳稻成熟种子除去颖壳，经75%酒精60 s、0.1%HgCl210min和NaClO 20min消毒处理后，播至愈伤诱导培养基，14 d剥离愈伤组织至愈伤继带培养基[11]，10 d后转至预培养基暗培养4 d，将愈伤组织浸没于农杆菌EHA105-NtFer1菌液中30min，置于共培养基20℃暗培养3 d，经筛选、分化和生根培养将幼苗移入壮苗营养液中培养，选出长势较好若干株自交并收获种子，将其播种于MS培养基（Kan 50mg·L-1+Fe2+300 μmol·L-1）进一步研究。

1.2.3转基因植株分子检测

试剂盒（原平皓，HF224）提取叶片基因组DNA。应用Primer Premier 5.0设计特异引物，Nt⁃Fer1-F（5'CCA CTA TCC TTC GCA AGA CCC TTC C 3'）和NtFer1-R（5'CAT CGC AAG ACC GGC AAC AGG ATT C 3'），PCR反应体系：模板0.5 μg，100 μmol·L-1引物各0.1 μL，10×Buffer（withmg2+）2.0 μL，2.5mmol·L-1dNTP 2 μL，5 U·μL-1Taq 0.2 μL，总体积20 μL。反应条件：94℃2min；94℃30 s，58.5℃30 s，72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物经1%凝胶电泳分离成像。DIG标记探针试剂盒（Roche）标记烟草铁蛋白基因NtFer1 cDNA为探针，参照《分子克隆实验指南》方法进行Southern杂交。Trizol法提取叶片总RNA，取30 μg 65℃水浴5min，经1%甲醛变性胶电泳分离后Northern杂交，方法同Southern杂交。

1.2.4转基因植株生理指标测定

经抗性筛选和分子检验后，将T1代转基因植株和非转基因对照移置壮苗营养液中培养（Fe2+300 μmol·L-1），45 d测定植株上部叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量，并重复3次；30、45、60和110 d测定植株上部叶片叶绿素相对含量，并重复3次。SOD活性采用氮蓝四唑光化学还原法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定，叶绿素相对含量利用SPAD502叶绿素仪（美能达，Japan）测定。

1.2.5转基因植株总Fe含量测定

根据Fe标准物绘制标准曲线，湿式消解-原子吸收法测定总Fe含量（原子吸收分光光度计Z-2000，Japan），计算样品加标回收率。取T1代转基因植株和非转基因对照植株（Fe2+300 μmol·L-1、45 d）上部叶片烘干后测定总Fe含量，重复3次；成熟籽粒去除颖壳、烘干粉碎测定糙米中总Fe含量，重复3次。

1.2.6转基因植株糙米氨基酸含量测定

取T1代转基因植株等质量混合样本及非转基因对照成熟种子，去除颖壳、粉碎、过筛、烘干，称取100mg，加入8mL 6mol·L-1HCl吹入氮气封口，110℃水解22 h，冷却过滤定容至50mL，取1mL真空冻干加入1mL 0.02mol·L-1HCl，离心取上清0.8mL，过滤后全自动氨基酸分析仪（德国阿米诺西斯，A200）测定氨基酸含量，并重复3次。

1.2.7T1代转基因植株稻瘟病抗性分析

采集黑龙江省粳稻主产区稻瘟病小种样本，高粱培养基分离培养62个单孢菌株，菌体悬浮液调成浓度2×105孢子·mL-1，每个菌株取10mL悬浮液加入0.02%Tween 20混匀，喷雾器接种T1代转基因植株和非转基因对照三叶一心幼苗（Fe2+300 μmol·L-1营养液培养），27℃、湿度90%，暗培养24 h，然后保持27℃、湿度90%、12 h·d-1光照培养，按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准叶瘟分级标准，0、8、10和12 d调查叶瘟级别，根据病情指数公式计算稻瘟病病情指数[12-13]。

2　结果与分析

2.1转基因植株分子检测

为证明烟草铁蛋白NtFer1基因cDNA是否整合到受体植株基因组中，对T0代抗性植株PCR检测，抗性植株和质粒750 bp处均扩增出目的条带，初步证明外源基因整合到受体植株基因组中（见图1a）。从中选出3株长势较好抗性植株，进行Southern blot检测，其均能与探针杂交出条带（见图1b），进一步证明外源基因已整合到受体植株基因组中；分离总RNA进行Northern blot检测，转基因植株中均检测到相应外源基因NtFer1表达的mRNA信号（见图1c），表明外源基因NtFer1已在转录水平表达。对上述3个转基因植株自交的T1代抗性植株PCR检测，抗性植株和质粒均产生特异扩增条带，而非转基因对照则无特异扩增条带（见图2），表明外源基因已在受体植株中稳定遗传。

图1　T0代转基因植株检测结果Fig.1　Detection results of T0transgenic plants

图2　T1代转基因植株PCR检测Fig.2　PCR electrophoretogram of T1transgenic plants

2.2T1代转基因植株生理指标比较分析

SOD和POD是活性氧清除剂，在植物抗氧化胁迫中具有清除氧自由基、防止脂膜过氧化及维持活性氧代谢平衡功能，均属于抗氧化类酶[14-15]。MDA是脂质氧化终产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子交联聚合，具有细胞毒性，含量可作为评价细胞受到威胁严重程度指标之一。Fe2+300 μmol·L-1条件下转基因株系SOD活性显著高于非转基因对照5.52%～7.59%、POD活性显著高于非转基因对照12.6%～17.6%（见图3a、b），而MDA含量显著低于非转基因对照16.98%～23.48%（见图3c）。

图3　T1代转基因植株生理指标变化Fig.3　Change of T1transgenic plants physiological index

上述差异表明，过量Fe2+胁迫下外源铁蛋白基因NtFer1转入表达能提高粳稻抗氧化酶活性，抑制或降低脂质过氧化反应，降低MDA含量，提高叶片抗氧化能力。

叶绿素是绿色植物光合作用物质基础。研究表明，叶片叶绿素含量与SPAD值呈显著正相关，通过测定SPAD值可得到叶绿素相对含量[16-18]。Fe2+300 μmol·L-1条件下转基因植株叶绿素相对含量在30和45 d时有高于非转基对照趋势，但差异不显著，60和110 d时转基因植株叶绿素相对含量高于对照5.1%～7.3%，且差异显著（见图4）。表明过量Fe2+胁迫下外源铁蛋白基因NtFer1转入表达能提高植株叶片叶绿素相对含量。

图4　叶绿素相对含量Fig.4　Chlorophlly relative content

2.3T1代转基因植株总铁含量比较分析

Fe2+300 μmol·L-1条件下转基因植株叶片总铁含量高于非转基因对照14.46%～20.45%，且差异显著（见图5a）；转基因植株糙米总铁含量高于非转基因对照7.44%～11.46%，且差异显著（见图5b）。表明过量Fe2+胁迫下外源铁蛋白基因NtFer1转入表达可提植株叶片和糙米总铁含量。

2.4T1代转基因植株糙米氨基酸含量比较分析

300μmol·L-1Fe2+条件下转基因植株和非转基因对照植株糙米16种氨基酸总含量无显著差别，转基因植株糙米天冬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸和赖氨酸含量显著低于对照，谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸含量略高于对照。外源铁蛋白基因NtFer1转入对转基因植株糙米16种氨基酸总含量无显著影响，但少数氨基酸含量与对照存在差异。结果见表1。转入表达可提高植株稻瘟病抗性、降低稻瘟病叶瘟指数。

图5　T1代转基因植株总铁含量Fig.5　Total iron contents of T1transgenic plants

表1　糙米氨基酸含量Table 1　Amino acid content of brown rice

表2　稻瘟病叶瘟指数Table 2　Leaf blast index of rice blast

2.5T1代转基因植稻瘟病抗性分析

300μmol·L-1Fe2+条件下3个转基因株系稻瘟病叶瘟指数8、10和12 d均低于对照，其中转基因Nt2株系10、12 d分别低于对照16.3%、17.3%，且差异显著。表明一定条件下外源铁蛋白基因NtFer1

3　讨论与结论

生物与非生物胁迫是影响作物生长、发育和产量的重要限制因素。抽取地下水灌溉会使旱田含铁量增加数倍、稻田含铁量增加100倍，潜育性土壤中Fe2+含量均高于植物正常需铁量[19]，过量Fe2+胁迫会导致脂质过氧化、细胞膜损伤和MDA含量上升等[20-21]。徐晓晖等研究表明铁蛋白基因能提高植物过量Fe2+胁迫抗性[10]，叶霞等研究表明铁蛋白基因能提高植株叶片和果实铁含量[22]。本研究在过量Fe2+胁迫条件下转基因植株叶片总铁含量、糙米总铁含量和抗氧化酶活性（SOD、POD）较对照显著增加，而MDA含量显著低于对照，与前人研究结果相似[10,22]。研究表明过量Fe2+胁迫下植株叶片出现褐色斑点、叶绿素含量下降[8,23]，而本研究中转基因植株叶绿素相对含量60和110 d显著高于对照，推测外源铁蛋白基因NtFer1转入表达能降低植株游离铁离子含量并增加无毒、可利用铁离子贮藏量，大量可利用铁离子可促进叶绿素相对含量增加、延缓叶片失绿。本研究中过量Fe2+胁迫条件下转基因植株抗氧化酶活性（SOD、POD）及叶片和糙米总铁含量均高于对照而MDA含量低于对照，表明烟草铁蛋白基因NtFer1对提高植株过量Fe2+胁迫抗性具有重要作用。

本研究过量Fe2+胁迫条件下转基因株系稻瘟病指数低于对照，与程志强等研究结果相似[24]，通过对叶片总铁含量测定发现相近时间转基因植株叶片总铁含量显著高于对照，原因是叶片中相对较高的总铁含量抑制稻瘟病对叶片侵害，当稻瘟病病菌侵染叶片后受侵染部位铁蛋白释放储藏的铁离子，催化Fenton反应生成具有强氧化力的羟自由基（·OH）抑制稻瘟病病菌增长，而未受病菌侵染部位铁离子以可溶、无毒状态储藏在叶片铁蛋白中。烟草铁蛋白基因NtFer1对提高植株稻瘟病抗性具有作用，抗病机理则有待进一步研究。

本试验结果表明，烟草铁蛋白基因NtFer1整合到粳稻东农427基因组并稳定遗传表达，外源铁蛋白基因NtFer1转入表达提高植株抗氧化胁迫能力、叶片和糙米储藏铁离子能力，同时降低过量Fe2+对植株毒害程度、增强叶片对稻瘟病抗性。

[1]Zhou H J,Korcak R F,Wergin W P.Cellular ultrastructure and net photosynthesis of apple seedlings,under iron stress[J].J Plant Nutr,1984,7(6):911-928.

[2]龚子同,张效朴,韦启璠.我国潜育性水稻土的形成、特性及增产潜力[J].中国农业科学,1990,23(1):45-53.

[3]彭显龙,刘元英,罗盛国.铁胁迫下硒对水稻养分吸收的影响[J].东北农业大学学报,2011,42(8):92-95.

[4]Harrison Pm,Arosio P.The ferritin:Molecular properties,iron storage function and celluar regulation[J].Biochim Biophys Acta, 1996(12):161-203.

[5]Jiang T B.Isolation and expression pattern analysis of two ferritin genes in tobacco[J].Journal of Integrative Plant Biology,2005,47 (4):477-486.

[6]Jiang T B,Ding B J,Li F J,et al.Differential expression of endog⁃ enous ferritin genes and iron homestasis alteration in transgenic tobacco overexpressing soybean ferritin gene[J].Acta Gene Sin, 2006,33:1120-1126.

[7]Tang X,Zou D,Zhang L,et al.Different between ferritin genes overexpressing in transgenic tobacco[J].Genetics andmolecular Research,2014,13:3167-3185.

[8]Goto F,Yoshihara T,Shigemoto N.Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene[J].Nat Biotechnol,1999,17:282-286.

[9]Van Wuy Tswinkel O,Vansuyt G,Grignon N,et al.Iron homeosta⁃sis alteration in transgenic tobacco overex pressing ferritin[J].The Plant Journal,1999,17(1):93-97.

[10]徐晓晖,郭泽建,程志强,等.铁蛋白基因的水稻转化及其功能初步分析[J].浙江大学学报:农业与生命科学版,2003,29(1):49-54.

[11]赵宏伟,宋彦超.寒地粳稻再生体系的优化研究[J].东北农业大学学报,2013,44(7):32-38.

[12]张俊华,孙洪利,刘杨大川,等.黑龙江省稻瘟病菌生理小种鉴定[J].植物保护,2009,35(3):137-140.

[13]宋成艳.黑龙江省水稻新品种(系)抗稻瘟病性鉴定及利用[J].植物保护,2011,37(4):142-145.

[14]Chris B,Marc V H,Dirk I.Superoxide dismutase and stress toler⁃ance[J].Annu Rev Plant Pysiol Plantmol Biol,1992,43:83.

[15]Attipalli R R,Kolluru V C,Munusamy V.Drought-induced re⁃sponses of photosynthesis and antioxidantmetabolism in higher plants[J].JPlant Physiol,2004,161(11):1189-1202.

[16]薛香,吴玉娥.小麦叶片叶绿素含量测定及其与SPAD值的关系[J].湖北农业科学,2010(11):2701-2704.

[17]艾天成,李方敏,周治安.作物叶片叶绿素含量与SPAD值相关性研究[J].湖北农学院学报,2000(1):6-8.

[18]王娟,韩登武,任岗,等.SPAD值与棉花叶绿素和含氮量关系的研究[J].新疆农业科学,2006(43):167-170.

[19]霍莉莉,吕宪国,邹元春.三江平原水稻田耕层土壤铁随开垦年限的动态变化[J].水土保持通报,2011,31(3):22-25.

[20]密东林,朱光艳,方楠,等.嘧菌酯对玉米叶片抗氧化酶系活性影响的研究[J].东北农业大学学报,2015,46(6):15-21.

[21]李晓华,孙伟,房金凤,等.铁缺乏与过量对花生幼苗叶绿素、MDA含量和SOD、POD活性的影响[J].湖北农业科学,2015, 54(9):4408-4411.

[22]叶霞,黄晓德,姚泉洪,等.农杆菌介导菜豆铁结合蛋白基因（PvFer）转化番茄的研究[J].园艺学报,2007,34(2):489-492.

[23]窦彩虹,陈应武.铁蛋白超表达增强水稻的铁胁迫耐受性研究[J].河南农业科学,2008(10):30-32.

[24]程志强,郭泽建,徐晓晖,等.转铁蛋白基因增强水稻对氧化胁迫与稻瘟病菌的抗性[J].中国水稻科学,2003,17(1):85-88.

Research on gene function and japonica genetic transformation of tobacco ferritin geneNtFer1

TANG Xinhua1,JIANG Tingbo2,GAO Hongxiu1,WANG Jingguo1,ZOU Detang1(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030, China;2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

We transformated tobacco ferritin geneNtFer1 into japonica genome byAgrobacteriummediatedmethod,and the transformation was confirmed by resistance screening,PCR,Southern blotting and Northern blotting.T1generation was cultured in overmuch Fe2+nutrient solution,and then we tested the physiological and biochemical indicators.The results showed that comparing to the wild type plants,SOD, POD activity and relative chlorophyll content of transgenic lines were increased,while themDA content was decreased;the iron content in leaves and brown rice of transgenic lines were higher than the control,total amino acids(16 kinds)showed no significant difference,while some content had difference;after inoculation by rice blastmixed bacteria,the rice blast index of transgenic lines were lower than the control.Our research indicated that tobacco ferritin geneNtFer1 transgenic japonica could enhance the Fe2+storage ability of leaves and brown rice,and improve iron stress and rice blast resistance.

NtFer1;iron content;japonica;rice blast

S511；Q785

A

1005-9369（2016）04-0073-06

2015-12-24

“十二五”农村领域国家科技计划课题（2013BAD20B04）；国家科技支撑计划项目（2011BAD16B11,2011BAD35B02-01-01）

唐鑫华（1982-），男，实验师，博士，研究方向为作物分子遗传育种。E-mail:tangxinhua821@sina.com

邹德堂，教授，博士生导师，研究方向为水稻遗传育种。E-mail:zoudetang0103@sina.com