岳阳汉族人群HLA-C高分辨等位基因多态性分析

孙　昂，粟玉萍，代　敏，苏湘晖，胡　滨，陈　敏（岳阳市中心血站，湖南414000）

岳阳汉族人群HLA-C高分辨等位基因多态性分析

孙昂，粟玉萍，代敏，苏湘晖，胡滨，陈敏（岳阳市中心血站，湖南414000）

目的了解岳阳汉族人群人类白细胞抗原-C（HLA-C）高分辨等位基因多态性及分布特征。方法2014年10月至2015年8月采用基于Illumina Miseq二代测序技术对岳阳地区2 504例造血干细胞捐献志愿者HLA-C进行高分辨基因分型，直接计算等位基因频率，对其分布规律进行统计学分析。结果2 504例造血干细胞捐献志愿者中检出67个HLA-C等位基因，其中频率大于0.050 0的常见等位基因分别为C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01。HLA-C位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，观察值（0.880 2）与期望值（0.876 6）比较，差异无统计学意义（P=0.214 5）。结论获得了岳阳地区汉族人群HLA-C等位基因的分布规律和特征，为人类学、移植配型、疾病相关性等研究提供了参考数据。

HLA-C抗原/遗传学；等位基因；基因频率；多态性，单核苷酸；高分辨基因分型

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因系统根据编码分子的分布与功能不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3大类，HLA-C属Ⅰ类基因。HLA-A、HLA-B、DRB1基因是早期研究的与造血干细胞移植密切相关的3个功能基因，随着非血缘造血干细胞移植的增加，HLA-C基因在造血干细胞移植中的重要性日益受到重视［1］。目前，国外造血干细胞移植均对供患者进行HLA-C高分辨基因配型。本研究采用高分辨分型技术对岳阳地区2 504例汉族造血干细胞捐献者的血液标本进行HLA-C基因分型，旨在从高分辨水平了解HLA-C基因多态性及分布特征。

1　资料与方法

1.1资料

1.1.1标本来源本研究2 504例血样全部来自中华骨髓库湖南分库岳阳招募站2014年10月至2015年8月招募的造血干细胞捐献志愿者，全部为汉族，岳阳本地人，年龄18～45岁，身体状况符合捐献者健康征询要求，留取乙二胺四乙酸抗凝静脉全血5～8 mL。

1.1.2主要设备与试剂KAIAO K5500超微量分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司），TAILONG NP968全自动核酸提取纯化系统（西安天隆科技有限公司），Miseq高通道测序平台（美国Illumina），GeneAmp PCR System 9700型扩增仪（美国ABI），7500 Real Time PCR仪（美国ABI），DNA提取试剂（西安天隆科技有限公司，批号：E0814120131），HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQB1基因二代测序试剂（荷兰GenDx公司，批号：C-15000192）等。

1.2方法使用DNA提取试剂，在全自动核酸提取纯化系统上提取 DNA，DNA质量浓度大于 50 ng/μL，OD260/OD280比值为1.7～1.9。按照二代测序试剂盒说明书进行HLA-C等位基因高分辨检测，对无法确定的基因分型结果采用Zhou等［2］的方法进行精确分型。

1.3统计学处理采用直接计数法计算等位基因频率，应用Arlerquin3.5软件进行Hardy-Weinberg平衡检验，P＞0.05为观察值与期望值比较差异无统计学意义。

2　结　果

2.1岳阳汉族人群HLA-C基因频率和分布特征2 504份标本中检出HLA-C等位基因67个，频率大于0.050 0的常见等位基因分别为C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01，累计频率为0.723 4。2个以上亚型的HLA-C等位基因11个，分别为C*01、C*03、C*04、C*05、C*06、C*07、C*08、C*12、C*14、C*15、C*16位点，见表1。

表1　岳阳汉族人群HLA-C高分辨等位基因频率分布

续表1　岳阳汉族人群HLA-C高分辨等位基因频率分布

2.2Hardy-Weinberg平衡检验HLA-C基因位点观察值为0.880 2，期望值为0.876 6，观察值与期望值比较，差异无统计学意义（P=0.2145），符合Hardy-Weinberg平衡。

3　讨　论

HLA是人类最复杂的遗传多态性系统，是由一系列紧密连锁的基因组成的具有高度多态性的复合体。1956年开始进行HLA分型工作，随着科技的发展和研究的深入，HLA分型技术从最初的血清学技术发展到高分辨DNA测序技术，越来越多的HLA等位基因被发现，截至2016年3月底已确定HLA-Ⅰ类基因10 574个，其中HLA-C位点2 902个（数据来源于www.ebi.ac.uk/ipd/ imgt/hla/stats.html）。本研究采用基于Illumina Miseq二代测序技术（即边合成边测序，在生产新DNA链时加入被荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸，在合成互补链时释放出荧光信号，通过捕获荧光信号，转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息，经过多个循环后完整读取核酸序列［3］）对岳阳地区2 504例汉族造血干细胞捐献志愿者进行HLA-C基因分型，共检出67个HLA-C等位基因，11个HLA-C等位基因有2个以上亚型，分别为C*01、C*03、C*04、C*05、C*06、C*07、C*08、C*12、C*14、C*15、C*16位点，表明HLA-C基因具有较高的多态性；频率大于 0.050 0的常见等位基因分别为 C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01，分别为267例（0.053 3）、304例（0.060 7）、442例（0.088 2）、611例（0.122 0）、934例（0.186 5）、1 065例（0.212 6），占全部HLA-C等位基因的0.723 4。HLA-C基因位点观察值（0.880 2）与期望值（0.876 6）比较，差异无统计学意义（P=0.214 5），符合Hardy-Weinberg平衡。

HLA基因多态性及分布特征与人种、民族及地域有关，我国地域广大，南北地区汉族人群HLA基因分布存在差异［4］，HLA-C基因也存在差异，C*01：02、C*07：02、C*03：04、C*08：01、C*03：02为中国汉族人群常见等位基因。岳阳汉族人群HLA-C的分布特征与李桢等［5］研究的深圳汉族人群和夏玲等［6］研究的四川汉族人群比较，C*04：01：01：01分布存在差异（深圳汉族人群出现频率为0.0686，四川汉族人群出现频率为0.069 7，岳阳汉族人群出现频率为0.043 3），与梁晓岚等［7］研究的北方汉族人群比较，C*14：02：01分布存在差异（北方汉族人群出现频率为0.052 6，岳阳汉族人群出现频率为0.0443），可能与研究样本量大小、基因分型方法不同有关，也可能是岳阳汉族人群HLA-C基因分布具有其自身特点。

HLA-C位点位于人类第6号染色体短臂的HLA-A、HLA-B位点之间，全长4.5 kb，其编码产物属HLA-Ⅰ类分子，HLA-C位点曾被认为不具有多态性而未被重视，随着HLA分型技术的发展，人们逐渐发现，HLA-C与HLA-A、HLA-B基因一样，具有高度多态性［8］，其分布于有核细胞表明其参与了免疫反应，HLA-C可与杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）组成KIR/HLA-C信号传导通路，在免疫调节中发挥重要作用［9］。近年来，有关HLA-C基因与疾病相关性的研究不断深入，有研究发现，HLA-C-35 kb C/T与人类免疫缺陷病毒-1感染具有相关性［10］，HLAC1C1为山东汉族人群梅毒的抗性基因型［11］，HLA-C1基因组表达水平降低可引起早期复发性流产［12］，HLA-C基因相合的造血干细胞移植急性移植物抗宿主病的发生明显降低、存活时间明显延长［13］。随着研究的深入，HLA-C基因在个体抗感染免疫、肿瘤免疫、移植免疫及与疾病发生的相关性将逐渐被发现，对预防和早期诊断、治疗疾病具有重要意义。

［1］张弦，张艳玲，王建玲，等.HLA-A/B/C/DRB1/DQB1对非血缘造血干细胞移植影响的分析［J］.中国实验血液学杂志，2011，19（1）：143-148.

［2］Zhou M，Gao D，Chai X，et al.Application of high-throughput，high-resolution and cost-effective next generation sequencing-based large-scale HLA typing in donor registry［J］.Tissue Antigens，2015，85（1）：20-28.

［3］毛舒燕，梁婧文.测序技术发展状况及相关专利分析［J］.中国医药生物技术，2015，10（3）：271-276.

［4］黑爱莲，李伟，刘娜，等.中华骨髓库造血干细胞捐献志愿者HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨等位基因频率分析［J］.中国输血杂志，2009，22（4）：285-287.

［5］李桢，程良红，邹红岩，等.深圳汉族人群HLA-Cw，-DQB1基因座等位基因的多态性［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12（53）：10517-10521.

［6］ 夏玲，王珏，罗玫，等.直接测序法用于四川骨髓库汉族人群HLA-C等位基因分布的研究［J］.中国输血杂志，2010，23（8）：596-601.

［7］梁晓岚，韩俊领，李茜，等.中国北方汉族人群HLA-Cw*高分辨等位基因频率分析［J］.中国实验血液学杂志，2010，18（2）：486-489.

［8］夏玲，陈强.HLA-C位点在无血缘关系异基因造血干细胞移植中的作用［J］.中国输血杂志，2010，23（3）：230-232.

［9］林泉，成先桂，钟永明，等.广西壮族人群HLA-C基因多态性与神经纤维瘤病Ⅰ型相关性［J］.现代中西医结合杂志，2012，21（26）：2858-2859.

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［11］刘丽，庄云龙，乔文本，等.山东地区汉族人群HLA-C基因分组与梅毒的相关性研究［J］.中国输血杂志，2013，26（5）：450-452.

［12］尹璐，郭媛.绒毛滋养细胞HLA-C基因多态性与早期复发性流产关系研究［J］.白求恩军医学院学报，2012，10（3）：192-193.

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.043

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1009-5519（2016）17-2726-03

2016-05-13）