六氢吡啶类小分子化合物的合成及性质研究

程德军，黄　斌

(四川理工学院 材料与化学工程学院，四川 自贡 643000)



六氢吡啶类小分子化合物的合成及性质研究

程德军，黄斌*

(四川理工学院 材料与化学工程学院，四川 自贡 643000)

在介导HIV-1进入正常细胞的协同受体中，趋化因子受体CCR5具有重要的药理学意义，因此开发具有药代动力学性质良好、高选择性及高活性的小分子拮抗剂已成为研究的热点，活性的苯甲酰胺类非肽类小分子备受关注.以4-六氢吡啶酮盐酸盐合成了N-乙基-N-(4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中间体4)，以2-羟基-5-溴苯甲醛为原料，通过还原、消去及取代反应合成了4-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯(中间体7)，通过中间体制备了一种新的抗HIV-1候选化合物N-乙基-N-(N-(2-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺(8)，目标产物的结构经13CNMR、1HNMR、MS及IR确征，生物活性经CalciumFluxAssay，PBMC及SPAGTPγSAssay检测，表明该产物具有较高的生物活性.

甲酰胺；非肽类小分子化合物；六氢吡啶

获得性免疫缺陷(HIV-1)正在全球蔓延，严重破坏了人类的免疫能力.苯甲酰胺类非肽类小分子是一类新型的CCR5拮抗剂，具有高效的抗艾滋病活性，通过对苯甲酰胺以及取代官能团的转换和修饰有助于CCR5先导化合物的研发，用以防治人类HIV-1感染[1-5].日本Takeda公司研发了一种非肽类小分子拮抗剂TAK779，苯甲酰胺类基因突变型非肽类小分子具有抗HIV-1的功能[6].具有苯甲酰胺、六氢吡啶及活性卤素原子的非肽类小分子已成为关注重点.

基于非肽类小分子的苯甲酰胺、六氢吡啶环基本结构，作者采用Boc酸酐保护氨基，通过苯甲酰氯与氨基的氨解化得到中间体4(N-乙基-N-(4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺)；通过5-溴-2-羟基苯甲醛的羟基化反应得到中间体 7(4-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯)，最后通过氨基与溴原子氨解化，制备了一种新的苯甲酰胺类拮抗剂，反应温度不高，合成路线较短，总产率较高，采用13CNMR、1HNMR、MS及IR对其结构进行确证.CalciumFluxAssay，SPAGTPγSAssay及PBMC测试目标产物的生物活性和抗病毒性.合成路线如图1.

图1　N-乙基-N-(N-(2-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺的合成路线Fig.1　　　　Synthetic route to N-ethyl-N-(N-(2-((p-chlorobenzoxyyl) -5-bromobenzyl)-　　　4- hexahydropyridine)- 4-chlorobenzamide

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

对氯苯甲氯，AR，英国Alfa公司；丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氟乙酸、硼氢化钠、乙酸乙酯(EAC)、碳酸钾，AR，重庆川东化工有限公司；5-溴-2-羟基苯甲醛、4-六氢吡啶酮，AR，上海金赛医药化工有限公司；二碳酸二叔丁酯((Boc)2O)、三乙酰氧基硼氢化钠(STAB)、N-溴代丁二酰亚胺(NBS)，AR，上海隆盛化工有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)，AR，上海诺泰化工有限公司.

质谱仪，MSDVL，美国安捷伦科技公司；傅里叶变换红外光谱仪，TENSOR27，德国布鲁克公司；核磁共振波谱仪，AV600 600MHz，德国布鲁克公司.

1.2N-乙基-N-(4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中间体 4)的合成

1.2.1N-Boc-4-六氢吡啶酮(中间体 1)的合成

取丙酮50.0mL、4-六氢吡啶酮盐酸盐15.29g(0.10mol) 及水300mL依次加入250mL三口烧瓶中，搅拌15min后缓慢加入0.38g·mL-1的(Boc)2O丙酮溶液60.0mL，常温搅拌12h，蒸馏除去溶剂后用水及EAC萃取，用少量EAC再次萃取，无水Na2SO4干燥EAC层，过滤并蒸馏除去有机相得粉末状白色固体(中间体1)19.78g，产率88.1%.

1.2.21-Boc-4-乙胺六氢吡啶(中间体2)的合成

参照文献[7-8]的方法，取2.25g(0.027mol)乙胺盐酸盐及4.97g(0.026mol)中间体1加入装有10.0mL甲醇和60.0mLTHF的三口烧瓶中，搅拌15min后分批加入7.94g(0.037mol)STAB，40min后用少量水及50.0mLEAC萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏得黄色油状液体(中间体2)3.67g，产率64.6%.

1.2.3N-乙基-N-(N-Boc六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中间体3)的合成

参照文献[8-10]的方法，取2.5mLN,N-二乙基乙胺、20.0mLCH2Cl2及1.15g(0.005mol)中间体2加入250mL三口烧瓶中，加入新制的对氯苯甲酰氯1.15g，搅拌50min，蒸馏除去CH2Cl2，用少量水和50.0mLEAC萃取，无水Na2SO4干燥有机相，经柱层析(硅胶200～300目，石油醚(PE)∶乙酸乙酯(EA)=5∶1)纯化、干燥得无色油状液体(中间体3)1.43g，产率77.8%.

1.2.4N-乙基-N-(4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺(中间体4)的合成

取0.52g(0.001 4mol)中间体3、1.0mL的TFA及10.0mLCH2Cl2加入250mL三口烧瓶中，薄层色谱(TLC)检测无中间体 3后，蒸干CH2Cl2，再加入20.0mLCH2Cl2，蒸馏以除去残余的TFA，经柱层析(硅胶200～300目，PE∶EA= 10∶1)纯化、干燥得白色固体(中间体4) 0.42g，产率90.9%.

1.34-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯(中间体 7)的合成

1.3.12-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲醛(中间体 5)的合成

参照文献[11]的方法，取100mLDMF、4.25g(0.03mol)碳酸钾、4.86g(0.03mol)对氯苯甲氯、5.00g(0.025mol)5-溴-2-羟基苯甲醛加入250mL三口烧瓶中，常温下搅拌回流，TLC检测无5-溴-2-羟基苯甲醛后，终止反应.倒入分液漏斗，并加入150mLEAC萃取2次，EAC用NaHCO3溶液和饱和NaCl洗涤；蒸干EAC得灰白色粉末(中间体 5)7.35g，产率90.2%.

1.3.22-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲醇(中间体 6)的合成

参照文献[11]的方法，取100mL甲醇和6.50g(0.02mol)中间体5加入250mL三口烧瓶中，分批加入0.90g(0.023mol)NaBH4，常温搅拌2h，TLC检测无中间体5后，用NaOH溶液(2.0mol·L-1)淬灭反应，过滤并蒸干甲醇，用EAC及少量水萃取，蒸干有机相得白色粉末(中间体 6)6.10g，产率92.5%.

1.3.34-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯(中间体 7)的合成

参照文献[11]的方法，取5.35g(0.03mol)NBS、100mLCH2Cl2和7.52g(0.024mol)中间体6加入250mL三口烧瓶中，冰水浴并快速搅拌，分批加入8.0g(0.03mol)PPh3，加热至20 ℃，TLC检测无中间体6后，终止反应.过滤，饱和NaCl萃取，无水Na2SO4干燥有机相，浓缩并柱层析(硅胶200～300目，PE∶EA= 10∶1)分离，蒸干馏分得白色粉末(中间体7)8.81g，产率98.8%.

1.4N-乙基-N-(N-(2-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺的合成(目标产物 8)

取0.17g(0.001 2mol) 碳酸钾、10.0mLDMF、0.28g(0.001mol) 中间体4以及0.40g(0.001mol)中间体7加入50mL单口烧瓶中，20 ℃下搅拌，TLC检测无中间体7后终止反应，加入EAC萃取，EAC层经饱和NaCl洗涤，浓缩并柱层析(硅胶200～300目，PE∶EA= 10∶1)分离，蒸干馏分得白色粉末(目标产物8)0.34g，产率59.3%.

1.5生物结合性及抗病毒活性测试

SPAGTPγSAssay结合实验采用文献[12]的方法，细胞CHO/K1经离心处理，分散于裂解液 (pH7.5，5mmol·L-1EDTA，5mmol·L-1Tris-HCl，5mmol·L-1EGTA)中，经胰岛素针抽提、沉淀，再分散于缓冲液(pH7.5，1mmol·L-1EDTA，50mmol·L-1Tris-HCl，100mmol·L-1NaCl，5mmol·L-1MgCl2)中，在30 ℃中温育，加入已报道药物TD0232-2-25b、TD0232-2-25c及目标产物8(N-乙基-N-(N-(2-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺)，当化合物的抑制率达到或大于50%时，研究产物的[35S]GTPγS生物结合性，化合物的抑制率按公式处理：抑制率=100%×[1-(cpmcompound-cpmbasal)/(cpmagonist-cpmbasal)]；同样采用文献[12]的方法在CHO/CCR5上测定产物 8的生物活性(CalciumFluxAssay)和抗病毒活性(PBMC).

2　结果与讨论

2.1主要中间体及产物的结构表征

两种中间体4、7及目标产物8以核磁共振氢谱(1HNMR600MHzCDCl3)测定化学位移值；核磁共振碳谱(1HNMR150MHzCDCl3)测定化学位移值；用质谱(MS)测定分子离子峰，以表征中间体及目标产物的结构.所表征的结果见表1.

表1　中间体4、7及目标产物8的MS、13C NMR及1H NMR数据

以上分析测试结果表明，中间体 4为N-乙基-N-(4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺；中间体 7即是2-溴甲基-4-溴-1-((4-氯苄基)氧)苯；产物 8为N-乙基-N-(N-(2-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺.

2.2活性检测结果

产物8的生物结合性分析为SPAGTPγSAssay(IC50=7.14nM)和CalciumFluxAssay(IC50= 22.4nM)，抗病毒活性测试(EC50= 52nMPBMC细胞).与已知拮抗剂TD0232[12]相比，产物8的生物结合性CalciumFluxAssay半数抑制率稍高于TD0232(IC50= 18.1nM)，生物结合活性SPAGTPγSAssay优于TD0232的半数抑制浓度(IC50= 11.4nM)，虽然抗病毒活性稍不如TD0232-2-25b(EC50= 16.0nM)，但其抗病毒活性高于TD0232-2-25c的(EC50= 88.0nM)，表明该苯甲酰胺有一定的抗病毒活性以及较好的受体结合活性.

3　讨　论

为解决非肽类小分子抑制剂只能作用于CCR5的单个位点的问题，作者设计并合成了一种新的非肽类小分子，该小分子不但含有活性的苯甲酰胺基本结构，同时具有活性的氯代芳香环；在人体体液pH下，该分子的叔胺结构可以被质子化形成季铵盐，该产物具有两个叔胺原子；在苯环上引入疏水基团氯原子；亲水与疏水基团间以活性的六氢吡啶连接.通过这些结构的设计以增加目标产物的抗病毒活性和生物结合性.

中间体4(N-乙基-N-(4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺)以1-苄基-4-六氢吡啶酮为原料，为避免氨解化对氨基的影响，通过Boc酸酐保护氨基；中间体 7(4-氯苯甲氧基-4-溴-2-溴甲基苯)以5-溴-2-羟基苯甲醛、对氯苯甲氯为原料，通过羟基化、醛基还原及NBS溴化得到；最后，通过中间体 4、中间体 7的氨基化合成了一种新的苯甲酰胺类小分子拮抗剂N-乙基-N-(N-(2-对氯苯甲氧基-5-溴苯甲基)-4-六氢吡啶)-4-氯苯甲酰胺，其结构经MS、13CNMR、1HNMR及IR表征，采用的合成路线远少于其他CCR5拮抗剂[12-13]的合成步骤，其总产率(约为19.7%)较高，而且，反应条件不高.

产物显示了较好的生物结合性(SPAGTPγSAssay(IC50=7.13nM)、CalciumFluxAssay(IC50=22.3nM))；抗病毒活性测试结果(EC50= 52nM)显示，主要为苯环结构对抗病毒活性有影响，阻挡了非肽类小分子与CCR5的位点结合；抗病毒活性测试表明该产物有一定的抗病毒活性，可以作为一种潜在的CCR5拮抗剂.

目前，针对苯甲酰胺及六氢吡啶小分子拮抗剂的研究刚刚起步，这类非肽类小分子具有较好的抗病毒活性及生物结合性，可能在治疗HIV-1领域内具有潜在医用价值.

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(责任编辑于敏)

Studyonthesynthesisandpropertiesofhexahydropyridinesmallmoleculecompounds

CHENGDejun,HUANGBin*

(DepartmentofMaterialsandChemicalEngineering,SichuanUniversityofScience&Engineering,Zigong643000,China)

ChemokinereceptorCCR5hasanimportantsignificanceforpharmacologywhenmediatedHIV-1goesintotheco-receptorinnormalcells.Itisnecessarytodevelopsmallmoleculeantagonistswithgoodpharmacokineticproperties,highselectivityandhighactivity,whichhasbecomeahotspot.Amongthesesmallmoleculeantagonists,benzamidenon-peptidesmallmoleculecompoundshaveattractedmoreresearchfocus.Inthiswork,N-ethyl-N-(4-hexahydropyriddine)-4-chlorobenzamide(intermediate4)wassynthesizedfrom4-piperidinone,and4-chlorobenzoxyyl-4-bromo-2-bromomethylbenzene(intermediate7)wassynthesizedfrom2-hydroxy-5-bromobenzaldehyde.FurthermoreanewHIV-1candidatecompoundN-ethyl-N-(N-(2-((p-chlorobenzoxyyl) -5-bromobenzyl)-4-hexahydropyridine)-4-chlorobenzamide(intermediate8)waspreparedbytheintermediate4and7.Inaddition,thecompoundswerecharacterizedby13CNMR,1HNMR,IRandMS.ThebiologicalactivitywasdetectedbytheCalciumFluxAssay,PBMCandSPAGTPγSAssay.Theseresultsindicatedtheproductshadhighlybiologicalactivity.

formamide;non-peptidesmallmoleculecompounds;hexahydropyridine

10.3969/j.issn.1000-2162.2016.02.014

2015-07-09

四川省教育厅科研项目(15ZB0215)；四川省自贡市重点科技计划项目(2014ZC01)

程德军(1976-),男，四川仁寿人，四川理工学院讲师，硕士; *黄斌(通信作者)，四川理工学院教授，E-mail:huangbin731026@126.com.

O621.3

A

1000-2162(2016)02-080-05