α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选反应体系的构建及其对乌龙茶的筛选

安品弟，褚克丹，马玉仙，蒋慧颖，陈　静，杨江帆（.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高等学校重点实验；.福建中医药大学药学院，福州 35000）

α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选反应体系的构建及其对乌龙茶的筛选

安品弟1，褚克丹2，马玉仙1，蒋慧颖1，陈静1，杨江帆1
（1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高等学校重点实验；2.福建中医药大学药学院，福州 350002）

本文以pNPG作为底物，通过测定反应体系中pNP的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性并对传统的pNPG法进行优化，建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外筛选反应体系，并对7种乌龙茶进行筛选。结果表明武夷山的武夷岩茶黄片抑制活性最高。结论：本研究建立的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选反应体系具备了简单、快速的优点，适用于筛选乌龙茶中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

乌龙茶；α-葡萄糖苷酶；α-葡萄糖苷酶抑制剂；筛选反应体系

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种有效的口服降糖药，能够与小肠中的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位结合，阻抑酶活性的发挥，阻滞双糖水解为单糖，吸收时间后延从而对降低餐后高血糖起到有益的作用［1］。α-葡萄糖苷酶抑制剂除了对糖尿病及糖尿病并发症的预防和治疗有很好的效果外还能抑制蛋白及脂类糖基化［2］。我国资源丰富，但是大多数具有降血糖的药物还没开发，因此，丛天然产物中筛选新的低毒、高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂越来越受到人们的重视［3］。

茶叶有着悠久的饮用历史，因含有多种天然活性成分，而具有多种保健功能。早在民间人们就有用粗老茶叶来降血糖的经验。福建省泉州人民医院蔡鸿恩医师采用70年以上的老茶树，制成“宋茶”，对10例DM患者进行治疗观察，有效率达70%以上［4］。相关研究发现，茶可以影响糖代谢和胰岛素的信号转导，可以降低患糖尿病的风险［5］。但有关茶叶对α-葡萄糖苷酶活性的影响还未见研究报道，为此，课题组建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选反应体系并对全国有代表性的7种乌龙茶进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

茶叶样品均属于市购，室温、避光贮存，详细情况见表1，α-葡萄糖苷酶，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），还原型谷胱甘肽均购自Sigma公司；对硝基苯、碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等均为分析纯。

恒温水浴锅（中国）；AR5120 Sartorius电子分析天平（瑞士赛多利斯）；电热恒温鼓风干燥箱（上海姚氏仪器设备有限公司）；紫外分光光度计UV-5800（美国安捷伦科技）。

表1　茶叶样品

1.2试验方法

（1）pH6.8、67mmol/L的磷酸缓冲溶液：取 KH2PO49.118g，K2HPO415.292g，混匀溶液，加去离子水水定容到1000mL。

（2）10mmol/L pNP：取0.0384g pNP置于棕色试剂瓶中，用磷酸钾缓冲液定容至25mL。

（3）20mmol/L pNPG：将0.6024g pNPG溶解于磷酸钾缓冲液并定容至100mL。

（4）0.1mol/LNa2CO3：10.6 gNa2CO3溶于1000mL磷酸钾缓冲液中，配成0.1mol/L的溶液。

（5）1g/L还原型谷胱甘肽：取25mg还原型谷胱甘肽溶于磷酸钾缓冲液中并定容至25mL。

1.2.2乌龙茶水提物的制备

依据各指标的特征值以及因子对于原始指标的载荷状况和公因子综合得分的计算公式，得到了安徽省16个地级市对5个公因子的得分，将五个得分相加，得到了各个城市的旅游产业发展实力综合得分(见表4)．综合得分为正值，说明该市旅游发展综合水平居于平均发展水平之上，且数值越大，说明旅游产业发展状况越好；反之，综合得分为负值，说明该主成分的水平在平均发展水平之下，且负值越低，说明旅游发展状况越差[24]．

将岩茶黄片粉碎过筛（20目），称取5g磨碎茶样，加175mL去离子水，在80℃水浴锅中提取30min，提取2次，提取时间30 min。将2次提取液冷却、合并，真空抽滤，得澄清液体。

将10mmol/L pNP，稀释成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L的不同浓度，然后分别取出1ml，加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml。于波长为400nm处测定吸光度值，试验重复3次，每次设3个复管。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选反应体系的建立

a、反应时间对酶反应的影响

反应体系为67mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.8）2mL，加入3.84U/ mlα-葡萄糖苷酶溶液50μL，1g/L还原型谷胱甘肽50μL，37℃保温10min后，加入20mmol/L pNPG30μL，37℃反应0、5、10、15、20min后，加入0.1mol/ LNa2CO3溶液10ml终止反应，于波长为400nm处测定吸光度值［6］，确定酶反应的适宜时间。

b、底物添加量对酶反应的影响

应用1.2.4.1节反应体系，分别加入20mmol/L pNPG10、15、20、25、30、35、40、45、50μL，37℃保温10min后再分别加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml终止反应，于波长为400nm处测定吸光度值，确定酶的添加量。

c、酶添加量对酶反应的影响

应用1.2.4.1节反应体系，分别加入α-葡萄糖苷酶溶液30、35、40、45、50、55、60、65、70μL，37℃保温10min后再分别加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml终止反应，于波长为400nm处测定吸光度值，确定酶的添加量。

d、正交实验设计

以酶活力为指标，采用正交试验，分别对影响酶活的3个因素反应时间、酶添加量、底物添加量设计3个水平，因素水平表见表2。

1.2.5不同乌龙茶对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

采用在1.2.4节中建立的筛选反应体系，加入浓度为15mg/mL的待测样品液（即1.2.2制备的茶汤溶液）500μL，反应后于波长为400nm处测定吸光度值，同时设置空白组（不加样品）、背景组（只加样品）。根据空白组、样品组、背景组的吸光度值（A空白、A样品、A背景）。计算抑制率。其中酶活力单位定义：在37℃，pH值6.8条件下，1 min内水解pNPG释放1 μmoL pNP所需的酶量 （U）。抑制剂活力单位定义：在相同条件下降低1个酶活力单位所需的抑制剂量。以阿卡波糖为阳性对照。

抑制率=［A空白-（A样品-A背景）］/A空白×100%

表2　正交试验因素水平表

2　结果与分析

2.1pNP标准曲线

pNP的浓度和吸光度值之间的线性关系为：y=2.112x-0.0244，R2= 0.99908。结果见图1。

图1　pNP标准曲线

2.2α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选反应体系的影响因子

本实验固定底物添加量pNPG30μL，pH=6.8，考察反应时间、反应温度和酶液添加量对酶反应的影响。见图2-4。

图2　酶促反应速率曲线

图3　酶液添加量对酶反应的影响

图4　温度对酶反应的影响

可以看出pNP的生成量是随着时间的不断增加而增加的，当反应时间为10min时，pNP的生成量最大，因此可以判定酶反应的最佳时间是10min；由图3可以看出当酶液添加量为45μL时，酶活力最大，因此可以判定酶液的最佳添加量为45μL，由图4可以看出，随着温度的增高，酶活力随之增大，当温度为40℃时，酶活力最高，当温度超过40℃时，酶活力开始下降，因此，可以判定酶反应最佳温度是40℃。

2.3筛选反应体系的条件优化

由结果可知，反应时间、反应温度、酶液添加量对酶活的影响分别是：反应温度＞反应时间＞酶液添加量，根据k值分析的结果，体外α-葡萄糖苷酶抑制筛选反应体系的最佳反应条件为A2B3C3，即：反应温度37℃，反应时间15min，酶液添加量55μL。在此条件下，其活力均高于正交试验的9组实验组合的活力，其酶活力平均值为68.9U。

表3　正交实验结果

表4　方差分析

*差异显著（P＜0.05）；**差异极显著（P＜0.01）

2.4乌龙茶对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

利用本实验构建的反应体系对全国7种乌龙茶筛选测试。通过测定比较不同乌龙茶对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50，IC50越小，表明抑制效果越好；IC50越大，表明抑制效果越差。不同乌龙茶对α-葡萄糖苷酶的抑制活性依次为：岩茶黄片＞凤凰单丛＞安溪铁观音＞冻顶乌龙＞漳平水仙＞文山包种，且岩茶黄片对α-葡萄糖苷酶的抑制作用分别是安溪铁观音的1.4倍、漳平水仙的1.5倍、冻顶乌龙的1.3倍、文山包种的1.6倍。

表5　不同乌龙茶提取物的酶抑制率

3　讨论

我国茶资源丰富，中国和日本民间都有用粗老茶医治糖尿病的传统。大量的文献报道乌龙茶具有降血糖功效，如何丛乌龙茶中快速、有效的筛选出治疗糖尿病的有效成分对于茶资源再利用和新的茶叶保健品开发具有重要意义。目前虽报道有2型糖尿病药物的筛选反应体系［7-9］，但为适应开展大规模筛选乌龙茶的需要，本实验采用正交试验法建立了便捷可靠的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选反应体系。

本实验先通过单因素实验对影响酶活力的3个因素（反应温度、反应时间、酶液添加量）进行了考察，然后又通过正交实验法对3因素行了综合考察，丛正交实验结果分析看，各因素对酶活的影响按大小排列依次为：C（反应温度）＞A（反应时间）＞B（酶液添加量）。通过对各因素的分析研究，我们确定了反应体系的筛选条件。首先，依次加入55μL酶液、1g/L还原型谷胱甘肽50μL，振荡混匀，37℃保温10min，再加入20mmol/L的底物30μL，37℃反应15min，加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml终止反应，400nm处测定吸收值。

利用本实验构建的反应体系对全国7种乌龙茶筛选测试。通过测定比较不同乌龙茶对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度IC50，结果表明岩茶黄片的IC50最小，为3.15mg·mL-1，其抑制效果最好；文山包种的IC50最大，为5.05mg·mL-1，其抑制效果相对来说弱于其他6种乌龙茶。不同乌龙茶对α-葡萄糖苷酶的抑制活性依次为：岩茶黄片＞凤凰单丛＞安溪铁观音＞冻顶乌龙＞漳平水仙＞文山包种，且岩茶黄片对α-葡萄糖苷酶的抑制作用分别是安溪铁观音的1.4倍、漳平水仙的1.5倍、冻顶乌龙的1.3倍、文山包种的1.6倍。

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福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新培育专项（K80150001）。