猪基因PCR-SSCP分析条件优化的研究

刘燕河南农业职业学院

猪基因PCR-SSCP分析条件优化的研究

刘燕
河南农业职业学院

PCR-SSCP技术作为一种区分检测基因组之间微小差异的有效方法，具有快速、简便、灵敏和适用于大量样品筛选的特点。但影响基因测验的因素很多，为探讨猪基因PCR-SSCP分析的优化条件，经过反复对照实验发现，在凝胶浓度12%，电压4℃120v12h或室温下250v10min后120v10h，甘油浓度0%，电泳温度4℃等条件下效果最佳，条带最清晰。

猪PCR-SSCP条件优化

单链构象多态性 （sing1e strand conformation，SSCP）在分子标记领域和基因图谱的构建方面很受研究者的青睐，但试验效果易受诸多因素的影响［1,2］。此次实验根据目前国内外实验室和作者所积累的经验，对猪基因的PCR产物进行SSCP分析的试验条件进行了研究，主要从凝胶的浓度、电压的大小、甘油的浓度及温度的高低等因素出发，进行分析比较，旨在从中筛选出一种效果比较理想的实验条件，以提高该方法对猪基因突变检测的成功率，为进一步深入相关研究建立基础［2,3］。

一、试验时间及地点

2014年8月1日～2015年6月1日牧业工程学院生物分子公开实验室。

二、材料与方法

1.材料

（1）DNA提取试剂黄泛区南厂杜洛克猪血样加ADE抗凝,（标号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）、5M/LKI溶液、氯仿∶异戊醇（24∶1）、生理盐水、去离子水、异丙醇、70%预冷酒精、无水乙醇、一倍TE缓冲液等。

（2）PCR试剂及检测试剂Taq酶、引物1、引物2、10×buffer、dNTP，Agarose（琼脂糖）TAE缓冲液、EB染料、1oading Buffer染色剂等。

（3）PAGE凝胶试剂30%Acry1amide、5×TBE、10%过硫酸铵 （AP）、TEMED,20%NaOH、0.1%硝酸银、1% TBE、甲醛、醋酸等。

（4）主要仪器。离心机（博励行仪器有限公司,D-37520）、电子万用炉（天津市泰斯特仪器有限公司）、PCR仪（PTC-100，MJ Research，INC）、DYY-Ⅲ型电泳仪（北京六一仪器厂）、立式电泳槽（北京六一仪器厂）、凝胶成像系统（Ge1-Logic100，Kodak）、玻板、电热恒温鼓风干燥箱（天津市华北实验仪器有限公司,型号101-2s）、电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海伸安医疗器械厂,LD2X-408Ⅰ型）等。

2.主要方法

（1）DNA提取。①冷冻抗凝全血在室温下溶化后混匀，取300u1移至EP管中，加入1m1无菌双蒸水来回倒转十次溶解红细胞，13000r/min离心5min,弃上清，重复两次。②弃上清，加入1m1 0.9%的生理盐水，混匀，洗涤白细胞。13000r/min,离心5min弃上清。③向沉淀中加入100u1 5mo1/L碘化钾溶液，漩涡振荡30s,加入0.9%的生理盐水300μg，然后立即加入450mg氯仿：异戊醇混合溶液 （24∶1），充分混匀10min,13000r/min,离心5min。④取上清到另一EP管中，加等体积氯仿：异戊醇（24∶1），轻轻混匀，13000r/min，离心5min。⑤取上清到另一EP管中，加入等量异丙醇或两倍体积的无水乙醇，充分混匀，见有白色絮状物即为DNA,常温沉淀30min～1h。⑥加入预冷的200mg70%乙醇和无水乙醇，洗涤DNA,10000r/min离心3min，重复一次。⑦弃上清，待DNA晾干，加入50mg双蒸水，过夜溶解DNA，-20℃保存备用。

（2）PCR扩增反应体系及条件。①18mg的反应体系：模板3u1，DNTP：2.5u1,buffer：2.5u1，引物上下个：0.8u1×2=1.6u1，Taq：0.4u1,水：11u1。②PCR条件：预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：72℃，50s；保持10min。30个循环。③PCR产物检测：琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度，取Agarose0.3g，25mgTAE缓冲液在电热炉上加热至沸1～2min，加入EB染料3u1，冷却至不烫手，倒入加有点样梳的制胶漕中，直到凝胶变为不透明时，取5u1PCR产物与2u16×1oading Buffer染料混匀，用点样枪加入点样孔中，90v电压，30min后,紫外灯下检查PCR产物的纯度。结果如图-1所示。

图1

④PCR产物变性：加入变性剂在DNA热变性仪中94℃变性10min，取出迅速放入冰盒中冷却。

（3）SSCP分析：在研究以下条件时，其他条件保持一致。根据PAGE不同浓度配方表配制用0.1%硝酸银溶液染色15min后，用蒸馏水再洗一次，直接用20%的氢氧化钠溶液显色约15min左右，最后直接用冰乙酸蒸馏水终止染色。

三、实验结果与分析

1.凝胶的浓度

实验中以猪血全基因组中的内含子3基因为试验材料，用8%、12%和15%的凝胶电泳，经过银染后比较发现12%的凝胶电泳的条带较为清晰，效果最好，可用于SSCP分析（如图2～4）。凝胶的组成见表1，电泳结果见图-2-3-4。图2的分析条件较为成熟。

图2

图3　

图4

表1　不同浓度PAGE凝胶的配方表

2.电压的大小

由于SSCP电泳凝胶的浓度较高，所以如果电泳电压太大，如300v,则产热量大，导致中间跑得快而两边较慢，使带型成为弧形，有微笑效应（图6），影响电泳效果。经过多次试验比较，在室温下，一般垂直平板，电泳电压以250v10min，120v10h为宜。而在4℃时以低电压为宜，时间为10～12h效果更好（如图5）。

图5

图6

3.甘油或其他变性剂

凝胶中加入低浓度的变性剂，如5%～10%甘油，5%尿素或甲酰胺，10%二甲亚砜（DMSo）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变ssDNA的构象，增加分子表面积，降低了DNA的泳动率。甘油对不同样品的SSCP条带的泳动影响效果不一样，它对某些条带的泳动有促进作用，而对另一些则可能有抑制作用［4］，所以有些变异序列只能在没有甘油的凝胶中被检出。本实验发现甘油浓度为0%效果更明显。

4.电泳温度

温度恒定是SSCP分析的关键因素，在本实验中，发现室温下的条带明显差于4℃。室温下温度较高，在电泳时，温度还会继续升高，试验结果显示在室温下条带有“微笑”状。为确保电泳温度相对恒定，应减少凝胶厚度，降低电压，采取有效的空气冷却或循环水冷却等措施，也可在冰箱的冷藏柜中电泳。在没有冷却装置的情况下，可在开始的10min内用较高的电压如250v，然后在降低电压到120v电泳10h，也可收到满意的条带。

5.猪基因PCR-SSCP试验的最佳优化条件

经过反复的实验及对照，猪基因PCR-SSCP试验的最优条件为：凝胶浓度12%，甘油浓度0%，电压为室温下在开始的10min内用较高的电压如250v，然后在降低电压到120v电泳10h,但是4℃时低电压（120v）为宜，温度4℃时染色后条带细而清晰，能够准确分辨各基因型（如图7）。

图7

四、讨论

1.凝胶浓度

PCR产物电泳后条带必须保证单一无杂带，这是PCR-SSCP成功的基本和前提条件。魏太云等认为，凝胶浓度只影响电泳迁移率，通常选用的凝胶浓度6%～12%，凝胶浓度越高DNA泳动越慢，各单链之间距离越短［11］。而本实验恰恰说明凝胶浓度和交联度对实验影响最大，因为凝胶浓度和交联度决定了凝胶的孔径。孔径小，单链之间就能够分得更开，从而使条带更清晰。凝胶的厚度尽量要薄，可减少在泳动过程中产生的热量而影响实验效果。

2.电压大小

为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在低温下进行（一般4～15℃之间）。在电泳过程中，电压过高是引起温度升高的主要原因。温度过大会导致出现“微笑”条带或其他问题。另外，凝胶薄一点更好，凝胶越厚，电泳时产生的热量就越大。因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的 5min应用较高的电压（250V），以后用低压进行电泳。这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高。本实验中，PCR产物经变性电泳后，出现的条带较多，主要因为有的单链形成多种构象。如果上样量一定，出现的条带越多，那条带就会越淡，所以应该加大上样量并提高PCR产物和变性缓冲液的比例。

3.甘油浓度

目前普遍对加不加甘油的看法是：有的片段加，对迁移有促进作用；有的片段不加，反而促进迁移。有些学者认为甘油的浓度在5%～10%时SSCP分析的结果较好［5］。本实验中，发现在同等条件下0%甘油浓度的凝胶中条带整齐、紧凑，带型特征明显，甘油浓度增加反而会使条带不清或带型特征不明，在胶中的迁移距离缩短。所以，在SSCP分析过程中是否添加甘油、浓度究竟多大，应根据不同基因片段进行调整。

4.温度高低

本次试验中分离物条带的分离程度受温度变化的影响很大，由于在电泳时，温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应减少凝胶厚度，降低电压，采取有效的空气冷却或循环水冷却等措施，也可在冰箱的冷藏柜中电泳。如果没有冷却装置，则可在开始的几分钟用较高的电压（250v），然后在降低电压到100v左右开始电泳，这样既能使单链的DNA初步分开，又不使温度升高。

［1］魏太云，林含新，谢联辉．PCR-SSCP分析条件的优化［J］．福建农林大学学报，2002，（3）：22-25．

［2］何俊,曲湘勇,黄生强等.鹅基因PCR-SSCP分析条件优化的研究［J］.中国畜牧兽医,2006.

［3］欧阳建华,黄建安.PCR-SSCP技术的研究进展［J］.上海畜牧兽医通讯,2002.

［4］李玉梅,姚纪元,吴静等.PCR-SSCP技术的研究及应用进展［J］.生物技术通报,2007.

［5］蔡辉国,陈佩贞,张立冬等.PCR-SSCP分析实践［J］.生物化学与生物物理进展,1995.