突变型黄单胞杆菌产黄原胶条件的优化

张超凤，范丽君，李情敏，陈卫平，张凤英*

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

突变型黄单胞杆菌产黄原胶条件的优化

张超凤，范丽君，李情敏，陈卫平，张凤英*

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045）

该文对从甘蓝腐烂根部的土壤中分离选育的黄单胞杆菌C2发酵产黄原胶的条件进行了优化。通过单因素试验对培养基（碳源、氮源及碳氮源的浓度）和发酵条件（接种量、发酵时间、温度、pH、装液量）进行优化；为提高黄原胶的胶体性能，在培养中添加不同量的游离丙酮酸。结果表明，液态发酵生产黄原胶的最佳碳源、氮源分别为蔗糖55 g/L，鱼粉10 g/L。黄单胞杆菌C2菌株在接种量为4%，pH值为7，于28℃、130 r/m in条件下发酵60 h时，黄原胶产量达到34 g/kg。添加游离丙酮酸2 g/L时发酵液黏度为16.0 Pa·s，此时胶体性能最好。

黄单胞杆菌；黄原胶；发酵黏度

黄原胶（xanthan gum）是由黄单胞杆菌等产荚膜菌菌株发酵分泌的一种胞外酸性水溶性多糖［1］。因其具有良好的理化性质［2］，自20世纪50年代后期发现以来，到60年代初就开始进行商业化生产［3］。在1988年8月我国（原）卫生部批准了食品级黄原胶的卫生标准，并将其列入食品添加剂名单［4］。至今在食品［5］、化工［6］、化妆品、农药［7］等行业，黄原胶已被广泛利用。特别是在食品行业中，黄原胶对干酪的质构［8］、淀粉的糊化［9］和肉制品的品质［10］等方面有显著的效果。但与国外相比，由于起步晚，国内黄原胶的生产工艺技术还处于粗放型的初级阶段，存在着生产消耗高、收率低、产品质量差等诸多问题。据2010年资料统计，我国的黄原胶生产总量达到7.4万t，约占囯际生产总量的67%。然而，国内厂家的产胶技术仍然没有达到海外先进水平，企业效益和竞争力与国外相比，仍然比较低。

黄原胶的产量与菌株有关［12］，丙酮酸含量的不同会影响黄原胶的性质［13］。另外，在发酵过程中，培养条件（如温度、pH等）会影响黄原胶的性质［14］。尤其在液态发酵过程中，由于pH的变化较大，产量也随之变化较大［15］。

本实验利用从甘蓝腐烂根部的土壤中分离选育的黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris）C2发酵生产黄原胶，通过改变培养基中的碳源、氮源，发酵条件及游离丙酮酸

添加量，以期提高黄原胶产量、改善胶体性能。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

黄单胞杆菌C2：从甘蓝根部腐烂土壤中分离选育。1.1.2培养基

种子液培养基：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，牛肉浸膏3.0 g/L，pH7.0。

基础发酵培养基：蔗糖50.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，MgSO4· 7H2O 0.3 g/L，CaCO33.0 g/L，K2HPO4·3H2O 5.0 g/L。

牛肉膏培养基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl5.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH7.2～7.4。

1.2仪器与设备

754型紫外光分光分度计：上海光谱仪器有限公司；SPX-150B生化培养箱上海跃进医疗器械厂；PHB-8型笔试pH计：上海医用核子仪器厂；LDZX-40B型灭菌锅：上海申安医疗器械厂；HH-2型恒温水浴锅：国安电器有限公司；TGL-16C型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SPH-111F标准型恒温培养振荡器摇床：上海世平实验设备有限公司。

1.3方法

1.3.1菌体培养过程中生物量变化

从斜面选取黄单胞杆菌C2于种子液培养基中对菌株进行培养。装液量为50 m L/250 m L，在30℃、130 r/min条件下培养72 h。每隔12 h取3个三角瓶进行菌体生物量检测，观察其变化。

1.3.2培养基配方优化

碳源及其浓度的确定：分别以50 g/L的米粉、葡萄糖、蔗糖作为碳源替代基础发酵培养基中的碳源，考察其对产黄原胶的影响；选取合适的碳源后分别调整碳源质量浓度为35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L和60 g/L。装液量为50 m L/250 m L，在30℃、130 r/m in条件下发酵培养60 h。每个质量浓度做3个平行，测定其黄原胶产量［18］。

氮源及其浓度的确定：分别以5 g/L的鱼粉、蛋白胨、豆饼粉、麸皮作为氮源替代基础发酵培养基中的氮源，考察其对产黄原胶的影响；选取合适的氮源后分别调整氮源质量浓度为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L。装液量为50 m L/250 m L，在30℃、130 r/m in条件下发酵培养60 h。每个质量浓度做3个平行，测定其黄原胶的产量。

1.3.3发酵条件的优化

以上述试验中确定的最佳培养基配方为发酵液，在30℃、130 r/min条件下培养60h。分别考察接种量（2%、4%、6%、8%、10%），发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h），发酵温度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃），pH值（4、5、6、7、8、9、10），装液量（50m L/250m L、100m L/250m L、125m L/250m L、150 m L/250 m L）对黄原胶产量的影响。

1.3.4游离丙酮酸对黄原胶胶体性能的影响

在上述确定的最佳培养基和最佳发酵条件的条件下，分别添加1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L游离丙酮酸，考察游离丙酮酸质量浓度对黄原胶胶体性能的影响。

1.3.5测定方法

生物量：采用干质量法进行测定。

黄原胶产量：采用酒精沉淀法测定。

发酵液黏度：采用2，4-二硝基苯肼比色法进行测定。

2　结果与分析

2.1菌体培养过程中生物量变化

摇瓶培养（30℃、130 r/m in）不同时间，测定菌体生物量，并绘制生长曲线，结果见图1。

图1　菌体生长曲线Fig.1 Growth curve of strain C2

由图1可知，黄单胞杆菌C2在12～36 h处于对数期，菌体迅速繁殖。36 h后进入稳定期，菌体数量稳定。因此选定在发酵液中培养36 h的发酵液作为种子液接种发酵培养。

2.2碳源对生产黄原胶的影响

2.2.1不同碳源对黄原胶产量的影响

选择葡萄糖、蔗糖、米粉等常见且廉价的成分作为碳源，对其进行摇瓶试验，研究碳源对黄原胶产量影响，结果如图2。

图2　碳源对黄原胶产量的影响Fig.2 Effect of carbon sources on xanthan gum production

由图2可知，以蔗糖为碳源时黄原胶产量最高，米粉次之，葡萄糖作为碳源对黄原胶产量的影响并不是十分突出。可能是由于糖类除了作为碳源外，还具有维持一定渗透压的作用。由于葡萄糖为单糖，蔗糖为二糖，它们结构上的不同有可能使其在溶液中的渗透压出现一些差异。还有可能是因为糖经高温高压灭菌后，会导致培养基的pH值不同程度的降低，影响黄单胞杆菌的增殖，而蔗糖对pH的影响最小，利于保证黄单胞杆菌的生长环境。因此选择蔗糖为合适的碳源。

2.2.2蔗糖质量浓度对黄原胶产量的影响

在确定蔗糖为最佳碳源后，考察蔗糖质量浓度对黄原胶产量的影响，结果如图3。

图3　蔗糖质量浓度对黄原胶的产量的影响Fig.3 Effect of sucrose concentration on xanthan gum production

由图3可知，黄原胶产量随蔗糖质量浓度的增加而升高，当蔗糖质量浓度为55 g/L时，黄原胶产量最高。蔗糖质量浓度＞55 g/L以后，黄原胶产量基本不变。这可能是因为蔗糖浓度较低时，对于黄单胞杆菌的生长和产黄原胶均不足；随着碳源浓度的提高，细菌生长旺盛，黄原胶产量增加；当蔗糖的质量浓度为55～60 g/L时，细菌繁殖旺盛且稳定，使得黄原胶产量也较高。因此选择蔗糖的质量浓度为55 g/L。

2.3氮源对生产黄原胶的影响

2.3.1氮源对黄原胶产量的影响

选取常见的玉米粉、蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、麸皮作为氮源，摇瓶发酵做对比试验，研究不同氮源对黄原胶产量的影响，结果如图4。

图4　氮源对黄原胶产量的影响Fig.4 Effect of nitrogen sources on xanthan gum production

由图4可知，使用鱼粉作为氮源时黄原胶产量最高，之后依次是豆饼粉、蛋白胨、玉米粉和麸皮。因此选择鱼粉作为合适的氮源。

2.3.2鱼粉质量浓度对黄原胶产量的影响

由图5可以看出，鱼粉质量浓度为10～25 g/L时，对黄原胶产量的影响不大。氮源主要是用于黄单胞杆菌菌体的生长［19］，所以10 g/L的鱼粉已足够菌体的生长并使得黄单胞杆菌C2大量合成黄原胶考虑到成本，鱼粉质量浓度为10 g/L时最经济、高效。因此选择鱼粉质量浓度为10 g/L较为适宜。

图5　鱼粉质量浓度对黄原胶产量的影响Fig.5 Effect of fish m eal concentration on xanthan gum production

2.4发酵条件对黄原胶产量及发酵液黏度的影响

2.4.1接种量对黄原胶产量的影响

图6　接种量对黄原胶产量的影响Fig.6 Effect of inoculum on xanthan gum production

由图6可知，黄原胶产量随接种量增加而增加，接种量为4%时黄原胶产量较高。接种量继续增加，黄原胶产量基本不变，过多的接种并没有多大的意义反而会造成浪费。因此选择合适的接种量为4%。

2.4.2发酵时间对黄原胶产量的影响

图7　发酵时间对黄原胶产量的影响Fig.7 Effect of fermentation time on xanthan gum production

由图7可以看出，发酵12 h后，黄原胶产量开始迅速增加，60 h时黄原胶产量达到最高，发酵60 h后，黄原胶产量有下降的趋势。因此选择60 h为合适的发酵时间。

2.4.3发酵温度对黄原胶产量的影响

图8　发酵温度对黄原胶产量的影响Fig.8 Effect of fermentation tem perature on xanthan gum production

由图8可知，黄单胞菌适宜生长的温度为28～32℃，在此范围内黄原胶产量较高且温度对黄原胶的合成影响不是很大。发酵温度为28℃时黄原胶产量最高。因此选择28℃为合适的发酵温度。

2.4.4pH值对黄原胶产量的影响

图9　pH值对黄原胶产量的影响Fig.9 Effect of pH on xanthan gum production

由图9可知，发酵液的pH为4～7时，随着pH的增加，黄原胶的产量增加；发酵液的pH为7～10时，随着pH的增加，黄原胶的产量减少。虽然黄原胶具有一定的稳定性，pH对黄原胶的性质影响不大，但对菌体合成黄原胶还是有一定的影响。在溶液呈中性（即pH为7）时黄单胞杆菌的活性最高，黄原胶的产量也达到最高。因此选择pH7为合适的发酵pH值。

2.4.5培养基装液量对黄原胶产量的影响

由图10可知，随着培养基装液量的增加，黄原胶的产量在下降。因为菌体的代谢过程是有氧呼吸，随着装液量的增加，装置内的氧气下降，菌体的活性也随之降低，因而黄原胶的产量下降。由此选择在250m L三角瓶中加入50m L发酵液为最佳装液量。

图10　培养基装液量对黄原胶产量的影响Fig.10 Effect of the volum e o f medium on xanthan gum production

2.5游离丙酮酸的加入对黄原胶胶体性能的影响

由黄原胶生物合成的代谢工程可知，碳氮源合成黄原胶的代谢途径与丙酮酸合成黄原胶的代谢途径是不同的，即在初始发酵条件不变的情况下，游离丙酮酸的添加会影响黄原胶的胶体性能，发酵液黏度越高则胶体性能越好，而对黄原胶产量的影响较小。

图11　游离丙酮酸对黄原胶胶体性能的影响Fig.11 Effect o f contents of free pyruva te on xanthan gum produc tion

由图11可知，游离丙酮酸添加量为2 g/L时，发酵液黏度最高，为16.0 Pa·s，此时黄原胶胶体性能最好。当游离丙酮酸添加量＞3 g/L，会导致发酵液的初始pH下降，发酵液黏度降低，从而影响黄原胶的胶体性能。因此选择游离丙酮酸添加量为2 g/L。

3　结论

黄原胶是次生代谢产物，缩短菌种的生长期和延长的稳定期可提高其产量。本试验绘制了黄单胞杆菌C2的生长曲线，确定了对数期和稳定期分别为12～36 h和36～72 h。通过改变了发酵培养基中的碳氮源及其浓度和发酵条件，以降低生长期和延长稳定期，从而提高了黄原胶的产量。另外为提高黄原胶的胶体性能，向发酵液中添加一定量的游离丙酮酸。最终确定黄单胞杆菌C2产黄原胶的最适发酵培养基碳、氮源分别为蔗糖55 g/L，鱼粉10.0 g/L。菌株黄单胞杆菌C2发酵产黄原胶的最适条件为初始pH值为7，发酵温度28℃，接种量为4%，装液量50 m L/250 m L，发酵时间60 h，在此条件下黄原胶产量为34 g/kg。游离丙酮酸添加量为2 g/L时，发酵液黏度为16.0 Pa·s，此时黄原胶的胶体性能达到最好。

［1］张怀杰，吴忠俭.黄原胶的生产及其在食品工业的应用［J］.郑州粮食学院学报，2000，21（1）：79-83.

［2］汪多仁.黄原胶的开发与应用进［J］.牙膏工业，2003（2）：44-46.

［3］杨攫，张学欢，汪智蛛，等.黄原胶发酵及提取工艺的优化研究［J］.食品工业，2008（8）：20.

［4］杜风光，陈伟红，闫德冉，等.我国黄原胶生产的现状、存在的问题及对策［J］.食品科学，2001，22（10）：97-99.

［5］任英杰.黄原胶在食品中的应用［J］.中国果菜，2012（4）：45-47.

［6］任宏洋，王新惠.黄原胶的特性，生产及应用进展［J］.酿酒，2010，37（2）：17-19.

［7］冯建国，张小军，于迟，等.浅谈黄原胶及其在农药制剂加工中的应用［J］.高分子通报，2012（11）：91-96.

［8］肖杨，苗君莅，郑远荣，等.卡拉胶和黄原胶对酸性凝胶型再制干酪质构的影响［J］.食品科学，2012，33（23）：93-97.

［9］唐敏敏，洪雁，顾正彪，等.黄原胶对绿豆淀粉糊化和流变特性的影响［J］.食品科学，2013，34（21）：42-46.

［10］胡国华.功能性食品胶［M］.北京：化学工业出版社，2003.

［11］孙健，冯美琴，王鹏，等.亚麻籽胶，黄原胶与大豆分离蛋白对肉制品出品率和质构特性的影响［J］.食品科学，2012，33（21）：1-5.

［12］GARCIA-OCHOA F，SANTOS V E，CASAS J A，et al.Xanthan gum：production，recovery，and properties［J］.Biotechnol Adv，2000，18（7）：549-579.

［13］程蓉，张永奎，张春红，等.高丙酮酸黄原胶的发酵研究［J］.食品工业科技，2008，29（3）：234-236.

［14］PALANIRAJ A，JAYARAMAN V.Production，recovery and applicationsofxanthangum by Xanthomonascampestris［J］.J Food Eng，2011，106（1）：1-12.

［15］陈超，王君高，周喜燕，等.黄原胶发酵条件优化研究［J］.中国酿造，2009，28（4）：121-123.

［16］常春，徐桂转，李洪亮，等.黄原胶QH_（79）菌种的发酵工艺的研究［J］.郑州工业大学学报，2000，21（1）：92-94.

［17］程蓉，张永奎，张春红，等.高丙酮酸黄原胶的发酵研究［J］.食品工业科技，2008，29（3）：234-236.

［18］陈永红.野油菜黄单胞菌黄原胶发酵碳代谢流的研究［D］.上海：上海海洋大学硕士论文，2005.

［19］姚仕义，王希本，王金生.XCCNAU-92生产黄原胶的工业发酵培养基成份［J］.工业微生物，1998，28（3）：24.

Optim ization of fermentation conditions of xanthan gum-producing Xanthomonas campestris mutants

ZHANG Chaofeng，FAN Lijun，LI Qingm in，CHEN Weiping，ZHANG Fengying
（College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchnag 330045，China）

The fermentation conditions of xanthan gum producing Xanthom onas campestris C2that screened from rotted roots of cabbage were optimized.The medium composition（carbon source，nitrogen source and their concentration）and fermentation conditions（inoculum，fermentation time，temperature，pH and medium volume）were optim ized by single factor experiment.To improve the colloidal properties of xanthan gum，different amount of free pyruvic acid was added into the medium，and the results showed that the optimal liquid fermentation medium composition was sucrose 55 g/L and fishmeal 10 g/L.When the X.campestris C2was inoculated under the condition of inoculum 4%，pH 7，temperature 28℃，rotation speed 130 r/min and fermentation time 60 h，the production of xanthan gum was 34 g/kg.When adding free pyruvic acid 2 g/L in the medium，the fermentation viscosity was 16.0 Pa·s，and colloid performance was the optimal.

Xanthom onas campestris；xanthan gum；fermentation viscosity

TQ920．1

0254-5071（2016）05-0092-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．019

2015-12-14

江西省科技计划（20151BBF60039）

张超凤（1991-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。

张凤英（1964-），女，研究员，本科，研究方向为食品微生物学。