桑叶总黄酮提取工艺研究

穆建峰（汝南县动物卫生监督所，河南驻马店463300）



桑叶总黄酮提取工艺研究

穆建峰
（汝南县动物卫生监督所，河南驻马店463300）

紫外可见分光光度法测定桑叶总黄酮含量，并采用正交试验对桑叶中总黄酮的提取工艺进行优化，确定了采用丙酮-水系统溶剂、超声波提取方式提取桑叶中总黄酮的最佳提取工艺。实验结果表明：桑叶中总黄酮的含量为2.78%。丙酮-水系统超声波提取的最佳工艺参数是丙酮浓度为50%、超声波温度70℃、超声时间为40min、料液比为1：20。在此工艺条件下，桑叶总黄酮的提取率最高可达98.6%，RSD为0.22%，其吸光度值在2h内基本稳定。此方法重复性好，简单、易于操作。

桑叶；总黄酮；正交试验；提取工艺

桑叶（Mulberry leaves）系桑科植物（Morus albaL.）的叶，是我国传统的中药材，性味甘、苦、寒，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效［1］。桑叶不仅可以食用，还可以药用。现代中药已经对桑叶做了大量深入的研究，结果发现桑叶具有降血压、降血糖、抗菌、抗病毒和抑制癌症等药理作用［2］。桑叶是植物茎叶中黄酮类化合物含量较高的一种，所含黄酮的种类有芦丁、桑苷、槲皮素、异槲皮素、槲皮素-3-三葡糖苷、槲皮苦和二氢山茶素等成分［3］。

本文采用正交试验优化桑叶中总黄酮化合物的提取方法，确定提取桑叶中总黄酮的最佳提取工艺，为桑叶的开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

桑叶：采集于驻马店市郊区，10月采集后粉碎；

芦丁标准品:中国药品生物制品检定所；

丙酮、甲醇、乙醇、石油醚、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠均为分析纯试剂。

1.1.2试验所用仪器

分析天平，购于北京赛多利斯；

超声波清洗机，购于天津奥特赛斯；

紫外可见分光光度计，购于北京谱析通用；

水循环真空泵，购于郑州长城科工；

旋转蒸发仪，购于上海申顺；

粉碎机，购于河北中兴仪器厂；

恒温干燥箱，购于天津药典标准仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1原料的预处理

采摘新鲜的桑叶置于恒温干燥箱中60℃烘干36h，取出放冷，经粉碎机粉碎后过筛备用。

1.2.2标准溶液的配置和标准曲线的制定［4］

准确称取芦丁标准品10.38mg，使用50%乙醇溶液定容于50mL棕色容量瓶中，制成浓度为0.2076mg/mL的芦丁标准溶液。分别准确吸取芦丁标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于10mL棕色容量瓶中，分别加入5%的NaNO2溶液0.5mL摇匀，放置5min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.5mL，再过5min后再加入1mL1mol/L的NaOH溶液，混匀，用50%乙醇稀释至刻度。以50%乙醇为空白，用1cm比色皿，在400～760nm范围内扫描，发现芦丁标准溶液的最大吸收波长是510nm。在510nm下分别测定不同浓度的芦丁的吸光度。如表1。

表1　不同浓度的芦丁标准溶液吸光度值

以芦丁浓度C为横坐标，吸光度值A为纵坐标，采用Excel做最小乘法的线性回归［5］，得芦丁浓度C与吸光度A的线性关系：A=11.066C-0.0001，相关系数r=0.99975。如图1。

图1　丙酮浓度对提取率的影响

1.2.3桑叶中总黄酮的提取及测定［6］

准确称取2.0g桑叶粉末，置于磨口三角瓶中，使用50%丙酮溶剂、料液比为1:10，温度30℃、超声提取30min。减压过滤，滤渣用水洗涤，合并过滤液得第一次提取液。同法提取第二次，得第二次提取液。直至得第三次提取液。合并三次提取液减压蒸馏，回收溶剂至近干，加水约80mL溶解，加入20mL石油醚脱色两次，吸取石油醚层，用水将其定容至100mL容量瓶中，作为待测液备用。

取待测液5mL于25mL容量瓶中用50%乙醇溶液定容。按照测定芦丁标准溶液的方法测定其吸光度A。从桑叶中提取总黄酮的含量可按下式计算：

桑叶中总黄酮的提取率可按下式计算：

2　结果与分析

2.1桑叶中总黄酮的测定结果

按照1.2.3提取方法和测定方法，测定桑叶中总黄酮的含量为2.78%。此结果作为桑叶的“真实”含量，为下文计算超声波各因素提取效果作准备。

2.2丙酮浓度对超声提取效果的影响

按照1.2.3前处理方法，分别使用30%、40%、50%、60%、70%的丙酮，料液比为1：10，温度30℃，超声提取30min。丙酮浓度对总黄酮提取率的影响见图2（见下页）。根据试验结果得出丙酮浓度为50%时，提取效果最好。

2.3温度对超声提取效果的影响

按照1.2.3前处理方法，分别用30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的提取温度。以50%的丙酮，料液比为1：10，超声提取30min。温度对总黄酮提取率的影响见图3。根据试验结果得知：温度在高于40℃时，其对总黄酮的提取率影响较小。60℃时提取效果相对较好。

图2　丙酮对总黄酮提取率的影响

图3　温度对总黄酮提取率的影响

2.4料液比对超声提取率的影响

按照1.2.3前处理方法，分别用1:5、1:10、1:15、1:20、1:25的料液比在60℃下，有50%的丙酮超声提取30min。料液比对总黄酮的提取率的影响见图4。根据实验结果可以看出，当料液比为1:20时，总黄酮的提取率最高。

图4　料液比对总黄酮提取率的影响

2.5超声时间对提取率的影响

按照1.2.3前处理方法，使用50%丙酮溶剂，料液比为1:20，温度60℃，分别超声提取10min、20min、30min、40min、50min、60min。超声时间对总黄酮提取率的影响见图5。

根据试验结果可以看出，随着超声时间的延长在30min内，提取率有明显提高。在30min后，提取率升高不明显。

图5　超声提取时间对总黄酮提取率的影响

2.6正交试验对提取条件进行优化

表2　正交试验因素水平表

表3　总黄酮提取正交试验结果

为了获取桑叶中总黄酮的最佳提取条件，在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验设计，以丙酮浓度、超声温度、料液比和超声时间四个因素水平进行正交试验［7］。正交试验因素水平见表2。正交试验结果见表3。

从表3中极差R值可以看出，四种因素对桑叶中总黄酮的提取结果影响大小依次为：A=B＞C＞D。提取桑叶中总黄酮的最佳提取条件为A2B2C3D2，即料液比1: 20，50%丙酮在70℃提取40min。验证性试验结果表明，采用最佳提取条件桑叶中总黄酮的提取率可以达到98.6%。验证试验结果见表4。

表4　验证试验结果

2.7稳定性试验

按照1.2.3提取方法和测定方法，采用最佳提取工艺条件，分别在0min、30min、60min、90min、120min时间点上进行测定。RSD=0.22%，结果表明，桑叶中总黄酮的吸光度值在2h内基本稳定。结果见表5。

表5　稳定性试验结果

3　结论

本文对超声波提取方式提取桑叶中总黄酮进行了初步研究。以丙酮—水系统作为溶剂，采用四因素三水平的正交试验设计对桑叶中总黄酮的提取工艺进行优化，最终确定桑叶中总黄酮的最佳提取参数为：丙酮浓度50%、超声波温度70℃、超声时间为40min、料液比为1:20。在此工艺条件下，桑叶总黄酮的提取率可高达98.6%，且在2h内吸光度值稳定。结果表明该方法提取率高，稳定性好，且超声波提取方式简单，易于掌握，为进一步研究提供科学依据。

［1］国家药典委员会中华人民共和国药典 ［M］.中国医药科技出版社，2010.

［2］中国医学科学院药物研究所.中药志（第五册）［M］.北京:人民卫生出版社，1960:98-102.

［3］毛红骞，高红林.桑叶的主要成分功能及其在食品中的应用［J］.江苏调味副食品，2009，26（1）:30-36.

［4］曲中堂，王光利，项昭保，等.青果总黄酮的含量测定及超声提取工艺研究［J］.食品工业科技，2012，33（7）:291-294.

［5］李盈蕾，陈建华.荞麦总黄酮提取工艺研究 ［J］.安徽农业科学，2008，36（6）:2201-2202.

［6］黄泽元，王海滨，刘志伟，等.芝麻叶中总黄酮的最佳提取工艺研究［J］.农业工程学报，2004，20（6）:201-204.

［7］刘军海，任惠兰，裘爱泳.杜仲叶中总黄酮的提取工艺研究［J］.食品与机械，2007，23（4）:92-94.

Study on the Extraction Technology of Total Flavones from Mulberry Leaves

MU Jian-feng
（Animal Health Inspection in Runan Plain，Zhumadian 463000，China）

Total flavonoids from mulberry leaves were determined in this paper，Optimization of extraction process of total flavonoids in mulberry leaves by orthogonal test.The acetone-water system solvent，ultrasonic extraction to extract the best extraction technology of total flavonoids in mulberry leaves.The test results showed that the content of total flavonoids from mulberry leaves was 2.78%.The optimum process paramenters were acetone concentration of 50%，ultrasonic temperature 70℃，ultrasonic time 40min，ratio of solid to liquid was 1：20.Under these conditons，the recovery rate of total flavonoids from mulberry leaves is 98.6%，RSD 0.22%，the absorbance was stable within 2h.This method good reproducibility，simple，easy to operate.

Mulberry leaves；total flavonoids；orthogonal test；extraction process

Q946

A

1008-1038（2016）08-0012-04

2015-12-19

穆建峰（1980.11—），男，助理畜牧师，主要从事畜牧兽医方面工作