口腔白斑和鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒感染分析

陈　亮，黄晓峰，郭　平，吴非非

(1.皖南医学院第一附属医院弋矶山医院口腔科，安徽芜湖 241001;2.南京大学口腔医学院/南京市口腔医院病理科，江苏南京210008)



口腔白斑和鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒感染分析

陈亮1，黄晓峰2，郭平1，吴非非1

(1.皖南医学院第一附属医院弋矶山医院口腔科，安徽芜湖 241001;2.南京大学口腔医学院/南京市口腔医院病理科，江苏南京210008)

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)16/18感染与口腔鳞状细胞癌(OSCC)临床病理特征间的关系。方法原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)分别检测10例正常口腔黏膜，26例口腔白斑(OLK)和56例OSCC中的HPV16/18水平，分析不同组间HPV16/18阳性率间的差异和OSCC中HPV16/18感染与性别、年龄、TNM分期、组织学分化、淋巴结转移、吸烟的关系。结果ISH和IHC检测HPV16/18阳性率差异无统计学意义 (P>0.05)；OSCC和OLK患者中HPV16/18阳性率高于正常口腔黏膜(P<0.05)；OSCC中吸烟者HPV16/18阳性率明显高于非吸烟者(P<0.05)。结论HPV16/18感染是部分OSCC的发病因素,其与吸烟对OSCC发病具有协同作用。

肿瘤，鳞状细胞；白斑，口腔；口腔肿瘤；原位杂交；人乳头瘤病毒

口腔白斑(oral leukoplakia,OLK)是目前公认的口腔黏膜癌前病变，口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是具有不同程度鳞状分化的侵袭性、上皮性的恶性肿瘤，在口腔颌面部恶性肿瘤中居于首位。人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种特异感染人类上皮黏膜的环状DNA病毒，目前研究发现其感染也是部分口腔癌的致病因素，其中HPV16/18是具有高度致癌潜能的基因型。因此，本研究采用两种检测方法探讨OLK、OSCC中HPV16/18表达与临床病理特征间的关系，为进一步研究提供依据。

1　资料与方法

1.1一般资料收集南京大学医学院附属南京市口腔医院病理科56例患者的病理确诊且临床病理资料完整的OSCC标本，其中男29例，女27例；年龄30～82岁，平均58岁，0～<58岁24例，≥58岁32例； TNM分期(2002年UICC标准)：Ⅰ期13例，Ⅱ期14例，Ⅲ期8例，Ⅳ期21例；分化程度：高分化21例，中分化26例，低分化9例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移34例；非吸烟者36例，吸烟者20例。同时，收集同科室26份OLK标本，10份黏液囊肿边缘黏膜组织(检测为正常口腔黏膜)。

1.2方法

1.2.1试验材料用于原位杂交(ISH)的HPV16/18 特异性探针和免疫组织化学(IHC)HPV16/18兔抗人单克隆抗体即用型工作液均购于福州泰普生物科学有限公司。通用型EnVision IHC试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)、抗原修复液乙二胺四乙酸(EDTA)均为丹麦Dako公司产品。

1.2.2主要操作步骤10例正常口腔黏膜，26例OLK，56例OSCC标本均经10%甲醛固定，然后常规脱水，石蜡包埋和4 μm连续切片，最后经脱蜡及水化。IHC EnVision法主要步骤：标本切片经高温和高压抗原修复，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育30 min，最后经DAB法显色。ISH法主要操作步骤：标本切片微波杂交预处理，特异性探针杂交，信号放大，最后经组织细胞原位DAB法显色。

1.2.3结果判断探针和一抗采用PBS代替做出的试验结果作为HPV16/18阴性对照，已知HPV16/18阳性的尖锐湿疣作为阳性对照。IHC法检测：标本细胞核呈棕黄色团块样或弥漫性颗粒为HPV抗原(+)，反之为HPV抗原(-)。ISH法检测时标本细胞核呈棕褐色团块样或弥漫颗粒着色为HPV-DNA(+)，反之为HPV-DNA(-)。

1.3统计学处理试验数据采用SPSS17.0统计软件分析，计数资料用率表示，组间采用χ2检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1IHC、ISH法检测各组标本中HPV16/18的阳性率IHC法阳性细胞核呈棕黄色团块样或弥漫性颗粒着色(图1、2)，而ISH法阳性细胞核呈清晰的棕褐色团块样或弥漫颗粒着色(图3、4)。两种检测方法相比，ISH法检测结果镜下观察背景清晰，对比度强，阳性细胞并非都是挖空细胞。IHC、ISH两种检测方法检测所选标本HPV16/18阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)；HPV16/18感染率在OLK和OSCC间比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在OLK和OSCC中显著高于正常口腔黏膜(P<0.05)，见表1、图5。

表1　正常口腔黏膜、OLK、OSCC中HPV16/18的阳性表达(n)

图1　OLK中HPV16/18抗原(+)表达(IHC，×400)

图2　OSCC中HPV16/18抗原(+)表达(IHC，×400)

2.2HPV16/18阳性率与OSCC患者临床病理特征间的相关性HPV16/18阳性率与患者的性别、年龄、临床TNM分期、组织学分化程度及淋巴结是否转移均无关(P>0.05)，而在吸烟患者标本中HPV16/18阳性率显著高于非吸烟患者(P<0.05)，见表2。

图3　OLK中HPV16/18-DNA(+)表达(ISH，×400)

图4　OSCC中HPV16/18-DNA(+)表达(ISH，×400)

图5　ISH、免疫组织化学检测HPV16/18的阳性率

表2　HPV16/18阳性数与口腔鳞癌临床病理特征间的相关性

续表2　HPV16/18阳性数与口腔鳞癌临床病理特征间的相关性

3　讨　　论

OSCC呈侵袭性生长，是头颈部最常见的恶性肿瘤，约占90%，全球每年新增口腔癌病例近3万例[1]，主要致病因素包括烟酒、咀嚼槟榔、残根残冠及化学和生物刺激等。癌前病变中的OLK是以上皮异常增生为主要病理改变的一种黏膜病，癌变率为3%～5%。高危型HPV16/18可引起上皮的恶性肿瘤，最常见的是子宫颈癌，此外还是部分口腔癌[2-3]和口咽癌的主要致病因素[4-5]。

目前虽然有多种检测HPV感染的方法，但因材料、试验条件、判读标准等差异，同一组标本HPV阳性率存在差异。IHC利用抗体检测标本中HPV-Ag的水平，优点是操作简单、能定位，缺点是抗体针对衣壳蛋白常在复制晚期出现，会导致检测的低敏性和假阴性；ISH利用特异性探针与标本的HPV-DNA进行杂交，具有高灵敏和特异性，是比较理想的检测法，但常受到标本中HPV-DNA数量的影响[6-7]。本研究采用上述两种检测法分别对所选标本行HPV16/18检测，结果显示二者检测出的HPV16/18阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),但ISH法检测HPV16/18阳性的标本显微镜下较清晰。

研究HPV16/18感染与口腔鳞癌、癌前病变及正常黏膜的相关性，回顾文献可发现HPV16/18感染与口腔黏膜癌、OLK密切相关。Miller等[8]采用了Meta分析对1982～1997年间发表于Medline上有关HPV与口腔癌关系的文章进行了研究，结果显示口腔癌感染HPV的合并优势比是正常黏膜的5.37倍。Mattila等[9]在15.9%的OLK中检测到HPV，而Syrjänen等[10]在29%的OLK中检测出HPV。本研究OSCC和OLK中HPV16/18阳性率明显高于正常黏膜，结果与之前研究相一致[8-10]，提示HPV16/18感染可能是OSCC或是癌前病变的致病因素之一。但HPV感染和口腔黏膜癌变间的因果关系目前仍无法解释，其具体机制有待研究。

长久以来，烟酒被认为是OSCC的首要危险因素，但有近10%～20%的病例无烟酒史，这类肿瘤发病机制可能与病毒感染有关[11]。本研究分析HPV感染与OSCC临床资料(包含年龄、性别、肿瘤临床分期、组织分化程度、淋巴结是否远处转移及吸烟史)间的相关性，结果显示HPV感染仅与患者是否吸烟有关，提示吸烟与HPV感染对口腔癌的发生具有协同作用，与Schwartz等[12]研究相一致，但也有研究未发现二者有协同作用[13-14]。因此，二者在OSCC中的具体关系还有待进一步研究。

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[9]Mattila R,Rautava J,Syrjänen S.Human papillomavirus in oral atrophic lichen planus lesions[J].Oral Oncol,2012,48(10):980-984.

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Human papillomavirus infection in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma

Chen Liang1,Huang Xiaofeng2,Guo Ping1,Wu Feifei1

(1.Department of Stomatology,Yijishan Hospital,the First of Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu,Anhui 241001,China;2.Department of Pathology,School of Stomatology,Nanjing University/ Nanjing Stomatological Hospital,Nanjing,Jiangsu 210008,China)

ObjectiveTo investigate the correlation between HPV16/18 infection and the clinicopathological characteristics of oral squamous cell carcinoma (OSCC).MethodsHPV16/18 was detected by the situ hybridization (ISH) and immunohistochemical (IHC) in 10 cases of normal oral mucosa,26 cases of oral leukoplakia (OLK) and 56 cases of oral squamous cell carcinoma (OSCC).We analysed the difference of the HPV16/18 positive rate among groups,and explored the correlation between HPV infection and the gender,age,TNM staging,histological garde,lymph node metastasis and smoking in OSCC patients.ResultsThere was no significant difference between ISH and IHC in detecting HPV16/18 positive rate (P>0.05).The HPV16/18 positive rates in patients of OLK and OSCC were significantly higher than that in normal oral mucosa patients(P<0.05).The HPV16/18 positive rate in smokers was significantly higher than that in non-smokers of OSCC(P<0.05).ConclusionHPV16/18 infection is considered to be a pathogenic factor in OSCC.HPV16/18 infection and smoking have a synergistic effect on the pathogenesis of OSCC.

neoplasms,squamous cell；leukoplakia,oral；mouth neoplasms；in situ hybridization；human papillomavirus

陈亮(1983-)，主治医师，硕士，主要从事口腔颌面部肿瘤方面研究。

论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.022

R780.2

A

1671-8348(2016)22-3086-03

2016-02-08

2016-05-11)