水相中脂肪酶Lipase lipoprotein催化的Aldol缩合反应

丁 雁, 黄 和,2, 吴素文, 李 霜,2, 胡 燚,2



水相中脂肪酶Lipase lipoprotein催化的Aldol缩合反应

丁 雁1, 黄 和1,2, 吴素文1, 李 霜1,2, 胡 燚1,2

(1. 南京工业大学 生物与制药工程学院, 江苏 南京 210009;2. 材料化学工程国家重点实验室 南京工业大学, 江苏 南京 210009)

Aldol缩合是有机化学中最重要的C-C键形成反应之一，在化工、医药领域有着重要的应用。实验结果表明水相中Lipase lipoprotein脂肪酶(LPL)与咪唑添加剂能够协同催化芳香醛与酮的Aldol缩合反应，考察了添加剂种类及用量、水含量、温度、时间等因素对反应的影响。在优化的反应条件下，即在反应体系中添加水30%(v/v)，咪唑60%(mol)，酶0.2 g，35℃反应48 h，对于有吸电子取代基的芳香醛底物，能与脂肪酮、环酮、杂环酮等不同结构的酮以51.8%~92.5%的收率发生Aldol缩合反应。相比文献报道方法，具有环境友好、底物适用范围广、产率高、反应时间短等优点。

脂肪酶；咪唑；Aldol缩合；水相

1 前 言

酶在有机与生物合成中是一类重要的催化剂，因其具有高选择性、反应条件温和、环境友好、副产物少等优点，被广泛应用于医药、化工、食品、纺织、洗涤剂及能源等工业领域[1~4]。脂肪酶(lipase, E.C.3.1.1.3)主要是指一类能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶，广泛存在于动植物和微生物体中[5]，已成功应用于Aldol缩合、Knoevenagel缩合、Michael加成、Henry反应等多种C-C键形成反应[6~8]。

Aldol缩合被认为是有机化学中最重要的C-C键形成反应之一[9]，可用于多种天然或非天然有机化合物的合成中。在有机合成中有许多关于用酸[10]、碱[11]、有机小分子[12]催化的Aldol缩合报道，但发现来源更广泛、成本更加低廉、更加绿色高效的新型Aldol缩合反应催化剂仍然具有重要意义。2003年，Branneby 等[13]首次发现了脂肪酶具有催化Aldol缩合反应的活性，他们用天然南极假丝酵母脂肪酶(lipase, CALB)催化此反应，但仅限于丙醛和己醛等简单的脂肪醛且收率只有6%~12%。Li等[14]报道了水相中猪胰脂肪酶(Porcine Paoceneas Lipase, PPL)催化的不对称Aldol反应并提出了反应机理，收率为11.7%~96.4%，值为9.6%~43.6%，然而论文仅考察了硝基取代的苯甲醛与丙酮的反应。Guan等[15]发现PPL能催化杂环酮与各种有吸电子取代基的芳醛的不对称Aldol反应，在乙腈溶剂中反应120 h以上，最高收率为56%，此时值为46%。Xie[16]等发现了在酸性缓冲溶液中牛胰脂肪酶(lipase，BPL)能催化多种芳香醛与环酮类化合物的不对称 Aldol 反应，但该法不能应用于直链酮底物，如与丙酮反应时，反应没有选择性，收率仅为26%。

图式1 LPL催化4-硝基苯甲醛与丙酮Aldol缩合反应

Scheme 1 Aldol condensation of acetone and 4-nitrobenzaldehyde catalyzed by LPL

研究表明在酶催化反应中加入合适的有机小分子作为添加剂，可以改善酶的催化性能。Itoh等[17]研究了洋葱假单胞脂肪酶(lipase，PCL)催化2-氰基-1-甲基-乙酸乙酯的水解反应中，加入冠醚可以显著的改变其反应速率和立体选择性。Liu等[18]报道了在褶皱假丝酵母脂肪酶(lipase, CRL)催化酮洛芬酯的水解反应时，加入8%(w/v)吐温80可以使酶活性提高13倍，对映体选择率E值从1.2提高到6.7。Chen等[19]研究了N-杂环化合物添加对酶促反应的调控作用，发现咪唑可以促进D-氨基酰化酶(D-aminoacylase, DA)催化的Claisen-Schmidt反应。

Lipase lipoprotein脂肪酶(LPL)来源于黑曲霉，相比与BPL、CALB等成本要低得多。本文首先以对硝基苯甲醛与丙酮的Aldol缩合反应为模型，考察了添加剂种类和添加量、水含量、时间、温度等因素对反应的影响(Scheme 1)，并对反应底物的适用范围进行了研究，希望发展一种成本更低、效率更高、底物适应范围更宽的绿色Aldol缩合反应新方法。

2 实验(材料和方法)

2.1 仪器与试剂

Lipase lipoprotein脂肪酶(LPL)购自宁夏夏盛实业集团有限公司，其它药品和试剂均为市售分析纯。熔点测定使用WRS-1B数字熔点仪，温度未经校正；核磁共振用BRUKERAC-P400型仪测定。

2.2 实验方法

将2 mmol对硝基苯甲醛和1 mL去离子水、2.3 mL丙酮加入10 mL反应瓶中，然后加入0.2 g LPL、60%(mol)咪唑，35℃下搅拌反应，TLC(石油醚/乙酸乙酯1/1，v/v)监测反应进行情况，反应完毕后过滤除酶，滤纸和滤液分别用CH2Cl2和水洗涤三次[16]。滤液用无水MgSO4干燥后过滤，减压旋蒸，粗产物经柱层析[石油醚/乙酸乙酯，9/1~2/1，v/v]分离即可得到纯化的目标产物。

2.3 部分产物结构表征

(3i)1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.23 (d,= 8.5 Hz, 2H), 7.64~7.46 (m, 2H), 5.48 (s, 0.68H), 4.97 (d,= 7.6 Hz, 0.28H), 4.18 (s, 1H), 3.83 (d,= 12.4 Hz, 1H), 3.27 (s, 2H), 2.75 (s, 1H), 2.51 (dd,= 10.1, 5.8 Hz, 2H), 1.38 (t,= 20.0 Hz, 10H)。

(3j)1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d,= 8.8 Hz, 2H), 7.52 (d,= 8.6 Hz, 2H), 5.54 (s, 0.67H), 5.00 (d,= 8.1 Hz, 0.38H), 4.29~4.16 (m, 1H), 3.85 (dd,= 6.4, 1.3 Hz, 1H), 3.82~3.68 (m, 2H), 3.46 (dd,= 11.4, 9.9 Hz, 0.38H), 3.04 (s, 0.61H), 2.93 (dd,= 5.7, 4.8 Hz, 1H), 2.80~2.63 (m, 1H), 2.58~2.45 (m, 1H)。

3 结果与讨论

3.1 不同添加剂对反应的影响

从表1中可以看出添加剂的选择对于LPL催化Aldol反应有着重要的影响，当加入咪唑类添加剂时对反应有明显的促进作用，如以咪唑为添加剂时(Entry 5)，反应48 h后，收率可达71.6%。而18冠醚-6、-环糊精以及表面活性剂不能辅助LPL催化Aldol反应(Entry1-3)。对比单独以LPL和咪唑为催化剂时反应的收率(Entry6~7)，可以看出咪唑添加剂与LPL对此反应具有显著的协同催化作用，这与Chen等[19]报道的结果相似。

表1 不同种类添加剂对LPL催化4-硝基苯甲醛与丙酮Aldol缩合反应的影响

aReaction conditions: LPL (0.2 g), (30%(mol)), 4-nitrobenzaldehyde (2 mmol), acetone (2.3 mL), deionized water 1 mL, 35℃, reaction time (48 h);bIsolated yield;cWithout additive, LPL (0.2 g);dWithout LPL, 30 %(mol) imidazole;eWithout LPL, without additive.

3.2 咪唑添加量对反应的影响

图1考察了水含量为30%时，添加剂咪唑用量对反应的影响。随着咪唑用量的增加，该反应的产物收率也逐渐增加。当咪唑用量达到60%(mol)时，收率达到最大，此时再增加咪唑用量，产物收率基本不变。在此反应条件下，单独用60%(mol)咪唑催化收率仅为40%，再次证明了咪唑与LPL共同作用催化了Aldol缩合。因此，本文选择咪唑用量为60%(mol)对反应进行后续探讨。

3.3 水含量对反应的影响

反应中水含量会影响酶的活性中心、稳定性，甚至引起酶分子三维构象发生改变[20,21]，因此体系中水含量是影响反应的重要因素之一。图2考察了水含量对反应的影响。如图所示水含量对反应的影响较大——不加水时，反应基本不进行，产物收率仅为0.9%；随着反应体系中水含量的增加，产物收率也逐渐的提高，在水含量为30%(v/v)时，收率达到92.7%；继续提高反应体系中的水含量，产物收率会逐渐下降，可能是反应体系中过多的水导致底物的溶解度降低。因此，本文选择最佳水含量为30%(v/v)。

3.4 反应温度的影响

通常，反应温度对酶的活性构象、催化活性和稳定性有较大的影响[22]。由图3可见，在一定的温度范围内，随着温度的升高，反应收率会增加；当温度高于35℃时，收率会随温度的升高而降低，这是由于在较高温度下使酶发生变性导致。

3.5 反应时间的影响

图4考察了反应时间对反应收率的影响。由图可见产物收率随反应时间的增加而升高；反应进行到48 h时，反应基本达到平衡，收率为92.7%，再延长反应时间，产物收率基本不变。

综合以上实验结果，得到优化后的条件：水含量为30%(v/v)，添加剂咪唑为60%(mol)，催化剂LPL用量为0.2 g，在此条件下在35℃反应48 h，对硝基苯甲醛与丙酮的Aldol缩合反应收率可达92.7%。

图式2 LPL催化芳醛与酮类化合物Aldol缩合反应

Scheme 2 LPL-catalyzed Aldol condensation of ketones and other aromatic aldehydes

3.6 脂肪酶LPL催化Aldol缩合的底物扩展

在优化的反应条件下，对底物进行了扩展，结果见表2。从实验结果可以看出，对于芳香醛来说，取代基的电子效应对反应有着显著的影响。当取代基为强吸电子的4-硝基苯甲醛、3-硝基苯甲醛及2-硝苯甲醛时，收率分别为92.7%、90.6%、87.2%(表2,3a~3c)；而具有相对吸电子效应较弱基团的对氰基苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛和丙酮反应时，收率分别为60.1%，68.6%(表2,3d、3e)。除此之外，还发现不同结构的直链酮、环酮以及四氢吡喃酮、四氢噻喃-4-酮等杂环酮与4-硝基苯甲醛在此反应条件下也能获得较好的收率(表2，3f~3k)。

表2 LPL催化芳醛与酮类化合物Aldol缩合反应

aReaction conditions: LPL (0.2 g), imidazole (60 %(mol)), aromatic aldehyde (2 mmol), ketone (2.3 mL), deionized water 1 mL, 35℃, reaction time (48 h).bIsolated yield after silica gel chromatography.

为了凸显本方法的催化效率，以对硝基苯甲醛与丙酮以及环己酮的反应为代表，与文献报道的方法作对比，反应时间得到大幅度减少，且不需要调控pH或加入乙腈等其他有机溶剂，结果见表3。

表3 不同种类酶催化的Aldol缩合

Note: Yield for reaction catalyzed by PPL at 30℃ for 48 h[14]. Yield for reaction catalyzed by BPL at 30℃, pH 5.6 for 108 h[16].a.Yield for reaction catalyzed by chymopapain at 30℃, pH 4.91 for 120 h in MeCN;b.Yield for reaction catalyzed by chymopapain at 30℃, pH 4.91 for 240 h in MeCN[31]. Yield for reaction catalyzed by pepsin at 30℃ for 96 h[32]. Yield for catalyzed by trypsin at 30℃ for 144 h in water[33]

4 结 论

研究首次发现了脂肪酶LPL与咪唑协同作用下，可以高效地催化吸电子取代的芳香醛与脂肪酮、环酮、杂环酮等不同结构酮的Aldol缩合反应。相比文献报道的BPL、CALB等其他种类的脂肪酶，LPL成本更加低廉，且具有环境友好、底物适用范围广、产率高、反应时间短等优点。

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Aldol Condensation Catalyzed by Lipase Lipoprotein in Aqueous Phase

DING Yan1, HUANG He1,2, WU Su-wen1, LI Shuang1,2, HU Yi1,2

(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China;2. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China)

Aldol condensation is one of the most important carbon-carbon bond-forming reactions in organic synthesis, which is widely used in the preparation of chemicals and pharmaceuticals. The experiment results in this study demonstrate that lipase lipoprotein (LPL) and imidazole can efficiently co-catalyze the Aldol reaction of aromatic aldehyde and ketones in aqueous phase. The influence of different additives, additive loading, water content, temperature, reaction time on the enzymatic reaction was investigated. The optimum conditions were found as 30% (v/v) water content, 60%(mol) imidazole, lipase 0.2 g, reaction temperature 35℃ for 48 h. Aromatic aldehydes with electron-withdrawing substituents can react with aliphatic ketones, cyclic ketones and heterocyclic ketones with good to excellent yields (51.8%~92.5%). Compared with previously reported methods, this new procedure offers advantages including environmental friendliness, wider substrate scope, higher yields and shorter reaction time.

lipase; imidazole; Aldol reaction; aqueous phase

1003-9015(2016)01-0121-06

O621.3

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.01.018

2014-08-14；

2015-01-17。

国家高技术研究发展计划(863)(2011AA02A209)；杰出青年科学基金(21225626)；国家重点基础研究发展计划(973)(2011CB710800)资助项目。

丁雁(1990-)，女，江苏苏州人，南京工业大学硕士生。通讯联系人：胡燚，E-mail：huyi@njtech.edu.cn