GTP结合蛋白4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定*

刘勋，陈明，杨志惠

（西南医科大学附属医院病理科，四川泸州646000）

GTP结合蛋白4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定*

刘勋，陈明，杨志惠

（西南医科大学附属医院病理科，四川泸州646000）

目的:为了建立GTPBP4基因沉默的人结肠癌细胞株，研究GTPBP4基因对人结肠癌细胞株RKO细胞增殖和凋亡的影响，构建并鉴定GTPBP4基因RNA干扰慢病毒载体。方法：针对GTPBP4 mRNA设计siRNA，构建pGCSIL-GFPGTPBP4慢病毒载体，感染293T细胞，包装产生慢病毒，并进行滴度测定。将慢病毒转染人结肠癌细胞株RKO，通过Realtime PCR和Western Blot分析GTPBP4基因敲减效率。结果：结果显示，插入DNA序列与目的基因序列一致，提示插入人GTPBP4基因序列正确。293T细胞中病毒滴度的测定结果2×108 TU/mL。经siRNA慢病毒感染后，实验组RKO GTPBP4基因mRNA水平表达量受到显著抑制，Western Blot结果显示敲减效率达到72.9%。结论:GTPBP4基因RNAi慢病毒载体构建成功，可用于结肠癌生物行为等各方面的研究。

GTPBP4基因；RNA干扰；慢病毒载体；结肠癌

GTP结合蛋白4（GTP binding protein4，GTPBP4）基因，位于人染色体10p15-p14，基因库编号：DQ496111.1，是一条长12285bp的线性DNA序列[1]。该基因编码的蛋白为GTP结合蛋白，其作为一个分子开关，存在激活和失活两种状态。该蛋白参与60S核糖体亚基的生物合成。有报道称该基因与乳腺癌，白血病耐药性等有关[2]。在野生型P53相关性的乳腺癌中，GTPBP4表达的增高与患者生存率降低相关[3]。课题组前期实验结果显示结肠癌癌组织中GTPBP4 mRNA表达水平显著高于癌旁组织，为进一步了研究GTPBP4在结直肠癌发生发展中的作用，本研究拟构建人GTPBP4 RNA干扰（RNA inter-ference，RNAi）慢病毒载体并进行鉴定为后续结肠癌的相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞（慢病毒包装细胞）、RKO人结肠癌细胞株、PCR引物及慢病毒载体pGCSIL-GFP均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购自GIBCO公司，DMSO购自上海生物试剂厂，胰酶购自上海化学试剂公司。大肠杆菌菌株DH5α，Lipofectamine 2000，Trizol均购自Invitrogen公司。M-MLV逆转录酶、dNTPs、Rnase Inhibitor均购自美国promega，oligo dT购自上海生工，抗体Anti-GTPBP4 antibody购自abcam，Goat Anti-Rabbit IgG及Mouse anti-GAPDH均购自Santa-Cruz。

1.2 人源细胞的培养

细胞培养：从液氮中取出RKO与293T细胞株并复苏，在含胎牛血清FBS及DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、5%CO2。

1.3 GTPBP4基因的RNAi慢病毒载体构建、提取及鉴定

针对人GTPBP4基因序列，设计并合成针对GTPBP4特异性干扰序列RNAi-1：5'-CCGGGCGTAGTCTTGGTGTTGACATCTCGAGATGTCAACACC AAGACTACGCTTTTTG-3'；RNAi-2：5'-AATTCAAA AAGCGTAGTCTTGGTGTTGACATCTCGAGATGTCA ACACCAAGACTACGC-3'。将合成的DNA oligo溶于缓冲液中90℃，水浴15 min退火配对，形成带粘性末端的双链。再使用AgeI，EcoRI酶切线载体pGCSIL-GFP使其线性化，用T4连接酶将合成的双链DNA连接于酶切后的RNAi慢病毒载体上。用氯化钙制备感受态大肠杆菌，将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态DH5α中进行克隆扩增，对长出的克隆先进行PCR鉴定，再将PCR阳性克隆进行测序分析。针对此实验设计的阴性对照DNA单链序列为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。GTPBP4特异性干扰及阴性对照重组质粒分别命名为LVGTPBP4-RNAi（24998-1）及CON053。

1.4 GTPBP4 RNAi慢病毒包装及滴度检测

按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明操作。取细胞状态良好，处于对数生长期且细胞密度为70%～80%的293T细胞，转染前更换无血清培养基，加入pGCSIL-GFP载体20 μg，PHelper1.0载体15 μg和PHelper 2.0载体10 μg，与Opti-MEN混合均匀，再与稀释的Lipofectamine 2000颠倒均匀，采用共同转染细胞的方法转染293T细胞。于37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。48 h后，收集细胞上清液并在4℃的条件下，4 000×g离心10 min，再用0.45 μL的滤器过滤上清液，除去细胞碎片，得到病毒粗提取液；然后将病毒粗提取液4 000×g离心，约10～15 min，弃上清液，再离心＜1 000×g，时间2 min，得到的即为病毒浓缩液。采用孔稀释法测定病毒滴度，于96孔板培养转染的293T细胞，4 d后通过荧光倒置显微镜计数荧光细胞数，再根据视野中荧光表达的情况计算病毒滴度。

1.5 人结肠癌RKO细胞慢病毒感染

感染前，首先将目的细胞RKO复苏，将细胞悬液接种于含3 mL完全培养液的培养基中，并置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞状态良好并将处于对数生长期时，将其用胰酶消化，制成细胞悬液；再将制成的细胞悬液接种于6-well中，每孔细胞数约为5×104个，置于37℃5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到约30%；根据细胞感染复数（multiplicity of infection，MOI）值，加入适宜量LVGTPBP4-RNAi病毒（RKO细胞正常，加Polybrene，MOI为5的时候进行感染），将感染的细胞置于培养箱中培养，同时设置阴性对照组及空白对照组。若感染后细胞状态正常，则24 h后换液继续培养；3 d后观察荧光表达情况，如果感染效率（荧光率）大于80%，表明慢病毒转染成功，可进行收集细胞提取RNA及蛋白。若感染后细胞状态不佳有明显的细胞毒作用或者感染效率低于80%，则需要重新进行感染实验。

1.6 Real-time PCR检测GTPBP4 mRNA的表达

提取感染率超过50%的目的细胞，按Trizol操作说明书提取总RNA，再根据M-MLV操作说明将RNA逆转录合成cDNA。将引物、SYBR GreenⅠ染料、cDNA、水按照比例配置反应体系（反应体系试剂总量20 μL），进行Real-time PCR反应。反应条件为：预变性95℃，15 s，进行1个循环；之后每一步变性95℃，5 s；退火延伸60℃，30 s；共进行45个循环。（实验组引物序列：GTPBP4上游5’-CAGCCCTATGCGTTCACAAC-3’、下游5’-TCCCAGGAGTGTCTACAACCT-3’；阴性对照组引物序列：GAPDH上游5’-TGACTTCAACAGCGACACCA-3’、下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’）。根据PCR反应曲线得到各样品目的基因和看家基因的Ct值，计算2-ΔΔCt值进行定量数据统计分析。

1.7 Western Bolt检测目的细胞中GTPBP4蛋白的表达

提取目的细胞总蛋白20 μg，在浓度为10%的SDS-PAGE分离胶上进行电泳，120 mA，1 h。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。转膜条件：4℃，150 min，400 mA恒流。转膜后用封闭液封闭过夜，再进行双抗孵化。实验组一抗浓度1∶500，二抗浓度1∶2 000；对照组一抗浓度1∶5 000，二抗浓度1∶5 000。最后按照说明加显色液，再暗室曝光，显影。

2 结果

2.1 GTPBP4 RNAi慢病毒载体的DNA测定

挑选阳性克隆的大肠杆菌进行PCR鉴定。经PCR反应生成条带：连接入GTPBP4 RNAi的阳性克隆PCR片段大小为：343bp（从载体中切掉24bp）；没有连接入GTPBP4 RNAi的空载体克隆PCR片段大小为：306bp，PCR电泳图片如下（图1）。为保证合成的GTPBP4 RNA干扰序列表达框无误，挑选阳性克隆进行DNA测序鉴定，测序结果显示：插入的碱基序列片段与目的基因完全一致，表明GTPBP4 RNA干扰慢病毒载体构建成功。

图1 慢病毒表达载体的PCR鉴定（琼脂糖凝胶电泳）

2.2 GTPBP4 RNAi慢病毒重组体的包装及鉴定

采用上述方法使慢病毒转染293T细胞，培养293T细胞2 d后，用荧光显微镜观察细胞，细胞状态良好。用孔稀释法测定病毒滴度为2×108 TU/mL，说明病毒包装成功。

2.3 Real-time PCR分析GTPBP4 mRNA表达

统计数据结果显示，GTPBP4基因敲减后，其mRNA表达量低于阴性对照组（见表1），实验组与对照组的GTPBP4基因敲减率的差异具有统计学意义（P＜0.05）。经LV-GTPBP4-RNAi慢病毒感染后，实验组RKO细胞中GTPBP4基因在mRNA水平的表达量受到显著抑制（见图2）。

2.4 Western Bolt检测目的细胞中GTPBP4蛋白表达量

从Western Blot灰度结果分析可以看出，转染病毒后，实验组RKO细胞中GTPBP4蛋白的表达量较阴性对照组蛋白的表达量显著降低。GTPBP4基因沉默后，其蛋白敲减效率达到72.9%（见图3）。

图2 实验组与对照组RKO细胞中GTPBP4基因mRNA表达量

图3 实验组及对照组Western Blot扫面图片

表1 当MOI值为5时，LV-GTPBP4-RNAi慢病毒感染RKO细胞后GTPBP4基因mRNA敲减的定量数值及分析

3 讨论

结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，中老年为最高发年龄组[4]。近来结肠癌在我国的发病趋势更是逐年攀升；就全球范围看，结肠癌发病率占所有癌症的第4位，病死率为第2位[5]。结肠癌的诊断主要依靠病理检测，治疗则以手术为主，化疗、放疗为辅。但是在目前结肠癌患者的诊断中，晚期患者比例较高，且患生存质量及生存率较低[6]。提高结肠癌患者的生存率，必须早发现、早诊断、早治疗。结肠癌的发病机制较复杂，涉及多种抑癌基因和原癌基因相互作用[7]，因此结肠癌相关基因的研究一直是研究热门。如：近年来发现新抑癌基因NGX6与结肠癌细胞凋亡有关[8]；RECK和MMP-9在结肠癌组织中的表达对结肠癌的发生发展可能起着促进作用[9]；Survivin、Bcl-2[10]及PTEN[11]蛋白在结肠癌组织的表达可作为预测预后的因素之一；Raf激酶抑制蛋白、上皮型钙黏蛋白[12]、人软骨糖蛋白39（YKL-40）、及白细胞介素-6（IL-6）蛋白[13]在结肠癌组织中的表达可能与结肠癌的发生发展相关等。本课题亦是对结肠癌相关基因的研究，题组前期实验结果显示结肠癌癌组织中GTPBP4 mRNA表达水平显著高于癌旁组织，因此推断人GTPBP4可能在结肠癌发生机制中起着重要的作用。

RNAi技术是一种在转录后水平抑制相关基因表达的一种调节机制，其主要原理为双链RNA（double strand RNA，dsRNA）会诱导与之同源的目标信使RNA（message RNA，mRNA）降解，从而达到抑制特定基因表达的效果[14]。RNA干扰具备高特异性、高效性、可遗传性及远距离效应等，因此成为基因沉默的理想工具。慢病毒载体与传统的病毒载体相比具备以下优点：使目的基因在宿主细胞中长期稳定地表达；可转染细胞分裂的的各个时期；兼容多个转录启动子等[15]。慢病毒载体将RNAi片段导人宿主细胞，抑制同源mRNA的表达，使目的基因持续而稳定沉默[16]。国内外关于GTP结合蛋白4（GTP binding protein4 GTPBP4）基因的研究较少，此基因在肿瘤发生发展中作用不明确。为进一步探究GTPBP4在结直肠癌发生发展中的作用，本研究用pGCSIL-GFP载体，PHelper1.0载体及PHelper2.0载体构建慢病毒载体系统，成功感染RKO细胞株，并通过Real-time PCR及western-blot实验证明LVGTPBP4-RNAi使GTPBP4 mRNA和蛋白的表达受到明显的抑制，达到基因沉默的作用，为后续GTPBP4与结肠癌生物学功能研究奠定了基础。

1.Kim D,Park S,Sang HL,et al.Frequent downregulation of NGB/GTPBP in lung cancer[C].Proceedings of the 103rd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research[J].Cancer Res,2012,72（8）:3139-3139.

2.Chouchana L,Fernandez-Ramos AA,Dumont F,et al. Molecular insight into thiopurine resistance:transcriptomic signature in lymphoblastoid cell lines[J].Genome Medicine,2015,7（1）:1-12.

3.Lunardi A,Di Minin G,Provero P,et al.A genome-scale protein interaction profile of Drosophila p53 uncoversadditional nodesof the human p53 network[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010,107（14）:6322-6327.

4.康清杰,向征.结肠癌筛查和诊疗的研究进展[J].重庆医学,2015,28（3）:4001-4003

5.Siegel R,Naishadham D,JemaI A,et al.Cancer statistics [J],JAMA,2013,310（9）,982-982.

6.定薇,黄玉娥.结肠癌生存率的相关因素分析[J].数理医药学杂志,2005,18（1）:42-43.

7.刘静,黄红.结肠癌发病机制中原癌基因与抑癌基因研究及相关药物治疗进展[J].中国药房,2014,25（45）:4302-4304.

8.连平,郭勤,彭娅.抑瘤基因NGX6对人结肠癌细胞凋亡的影响[J].生物化学与生物物理进展,2008,35（10）: 1154-1160.

9.朱振新,王强,徐建.RECK、MMP-2和MMP-9基因在结肠癌组织中的表达及其意义[J].外科理论与实践, 2009,14（4）,407-410.

10.兰涛,张金生,任俊华.Survivin、Bc1-2在结肠癌组织中的表达及意义[J].生物医学工程与临床,2011,15（3）: 280-283.

11.秦雅静.PTEN、PI3K在结肠癌中的表达及意义[D].大连医科大学:临床医学硕士论文（2013）.

12.张广超,刘细平,何峰.激酶抑制蛋白和上皮钙黏蛋白在结肠癌旁黏膜及结肠癌中的表达及其在结肠癌发生、发展中的作用研究[J].中国医药导刊,2015,8:840-842.

13.杨阳,杨晶晶,宁宁.YKL-40和IL-6在结肠癌组织中表达变化的研究[N].安徽医科大学学报,2015,6:727-730.

14.桂坚斌,孙迎,高武.RNA二级结构在siRNA设计中的应用[J].北京生物医学工程,2012,31（6）:652-656.

15.王淑艳,张愚.慢病毒载体的设计及应用进展[J].中国生物工程杂志,2006,26（11）:70-75.

16.赵铁军,倪伟海,郑有芳.慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究[J].浙江师范大学学报;（自然科学版）,2014,37（2）:206-211.

（2016-03-30收稿）

Construction and identification of lentiviral vector for RNA interference targeting GTP binding protein 4

Liu Xun,Chen Ming,Yang Zhihui
DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,SichuanProvince646000,China

Objective：A lentiviral vector for RNA interference targeting GTP binding protein 4（GTPBP4）was constructed,which was used to establish a human colon cancer cell line,RKO to study the effect of GTPBP4 on cell proliferation and apoptosis.Methods：A siRNA targeting GTPBP4 mRNA was designed and cloned into a lentiviral vector to generate pGCSIL-GFP-GTPBP4.The virus was packaged in 293T cells and the titer of the virus was determined.Human colon cancer cell line RKO was transduced with the lentivirus,and the efficiency of the gene knocking-down was analysed by Real-time PCR and Western blot.Results：The identity of the plasmid was verified by DNA sequencing.After packaging,the titer of the virus was 2×108 TU/mL.When the virus was introduced into RKO cells,the expression GTPBP4 was inhibited at both mRNA and protein levels,with a knockdown efficiency of 72.9%on Western Blot.Conclusion：The lentiviral vector expressing of GTPBP4-RNAi was successfully constructed,which can be used in studying the biological roles/functions of GTPBP4.

GTP binding protein 4 gene;RNA interference;Lentiviral vector;Colon carcinoma

R78，Q75

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.016

*四川省科技厅科技计划项目（NO：14JC0091），泸州市科技局科技计划项目（2013 LZLY-J44）

刘勋（1991-），女，硕士生

杨志惠（1973-），女，博士。E-mail：Yzhih 73@126.com