海洋真菌BH0531代谢产物对感染根结线虫黄瓜保护酶的影响

蔡 爽，刘晓霞，申佩娟，黄 敏，孟庆恒，孙建华

（1.天津师范大学生命科学学院 天津 300387； 2.天津市动植物抗性重点试验室 天津 300387）

根结线虫（Meloidogynespp．）是一种内源固着性寄生线虫，是危害世界农业生产的主要病原物之一[1-2]。根结线虫的入侵会使植物膜系统受损从而导致伤害产生，此时，植物细胞中的防御酶发挥作用，对线虫胁迫产生生理生化响应[3]。防御酶系统主要包括 SOD、POD、CAT、PAL、PPO 等，它们参与植株体内的活性氧代谢，能够直接杀死、抑制病原物生长发育等[4]。例如，在根结线虫胁迫条件下细胞内产生的活性氧簇能够有效地启动黄瓜植株抗氧化酶系统[5]，而SOD、POD和CAT是植物体内主要的抗氧化酶，能够响应各种逆境因子造成的氧化胁迫[6]。POD和CAT在保护酶中主要起到酶促降解过氧化氢的作用，POD是防止膜脂过氧化的主要酶，CAT对细胞内组分活性状态有重要的保护作用[3]；PAL是植株体内苯丙烷代谢途径的关键限速酶，其活性的高低决定了植株体内多种次生酚类化合物、木质素、植保素、类黄酮等抗菌物质的合成效果，因而PAL在植物抗病代谢和次生代谢中均具有重要作用[7]。林文雄等[8]认为逆境胁迫下，叶片的脂膜透性增加，相对电导率增加，SOD、CAT和POD等保护性酶的活性降低，使保护性物质类胡萝卜素含量降低，MDA含量增加，膜脂过氧化作用增强。李淑菊等[9]在水杨酸对黄瓜几种酶活性及抗病性的诱导作用的研究中，发现水杨酸处理黄瓜后其体内PPO、POD和PAL活性均有不同程度的提高。

目前生产实践中常使用高浓度、高毒性的化学农药防治线虫，不仅对人类健康和生态环境造成危害，也不利于农业生产的可持续发展[10-11]。利用真菌代谢产物对线虫进行生物防治越来越受重视[12]。来源于海洋的枝顶孢霉（Acremnium，BH0531）是已被证实的具有很好杀线虫效果的海洋真菌，其代谢物具有分子质量小、易溶于水等特点[13]。在已用其代谢产物进行室内杀松材线虫和根结线虫试验的基础上，进一步将此代谢产物应用于温室盆栽试验，以探究其对盆栽黄瓜的生理状况和保护酶活性的影响，为该菌应用到生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.BH0531），菌种保藏号：CGMCC-5445，由天津师范大学生命科学学院微生物实验室提供。供试线虫：根结线虫（Meloidogyne incognita），采自感染根结线虫病的大棚。供试黄瓜品种：‘新津春四号’，购自天津市黄瓜研究所。

1.2 发酵液的制备

1.2.1 菌种活化 将保藏的菌种接入斜面培养基，26℃下静置培养6～7 d。

1.2.2 菌株发酵培养 取新培养的菌株斜面，加入无菌水洗下孢子，制备成1×106个·mL-1的孢子悬浮液，以2%接种量接入装有100 mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中。26℃下120r·min-1振荡培养4 d。

1.2.3 发酵液的制备 将培养好的菌液1000r·min-1离心去菌体，再经孔径为0.22 μm微孔滤膜真空抽滤，即为发酵滤液[14]。

1.3 根结线虫2龄幼虫（J2）的制备

采集大棚染病黄瓜根系，洗净泥土，剪成1～2 cm的根段，加入1%（φ）的次氯酸钠溶液，用粉碎机粉碎。分别过60、250、500目分样筛，收集500目分样筛节流物，即为根结线虫的虫卵粗提物。将40 mL虫卵粗提物倒入100 mL离心管中，在离心管下层注入40 mL 40%的蔗糖溶液，使其分为2层，3 500 r·min-1离心5 min，水层和蔗糖溶液层中间的白色悬浮物就是虫卵，用移液器吸出，用蒸馏水冲掉蔗糖溶液，得到纯净的虫卵。将虫卵放入25℃培养箱中培养，待虫卵孵化，采用贝尔曼漏斗法获取二龄幼虫，配制成1 000条·mL-1备用。

1.4 方法

1.4.1 试验设计及黄瓜幼苗处理 黄瓜种子经55℃热水浸泡10 min后，在30℃温水中浸泡6 h，再用吸水纸和锡箔包好，置于30℃环境中催芽24 h。待其发芽后，点种到育苗穴中，于30℃光照培养箱中继续培养。待其长出第二片真叶后，移栽到花盆中，共计30盆，每盆1株，分为A组（试验组）、B组（对照组），每组15株；所用土壤配比为V大田土∶V泥炭土∶V沙子=4∶4∶1，121 ℃湿热灭菌 1 h。待黄瓜长出 3 片真叶时（20 d），A组接种根结线虫，接种方法：根周围打5个孔（12.5 mm×20 mm），注入线虫悬浮液，接种量为每盆2 000条；B组15盆注入等量清水作为对照。同时，A、B组每盆分别加入 40 mL的BH0531菌株发酵滤液，以干物质含量计算，浓度梯度设置为：0（对照）、5、10、20、40 mg·mL-1，每个浓度设置3次重复。培养50 d后用于采样测定。

1.4.2 黄瓜幼苗丙二醛含量的测定 接种根结线虫30 d后，称取剪碎的叶片1 g，加入2 mL 10%（ω）TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mLTCA进一步研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2 mL（对照加2 mL蒸馏水），加入2 mL为0.6%（ω）TBA溶液，混匀物于沸水浴中反应15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定450、532、600 nm波长下的吸光值[15]。

1.4.3 黄瓜幼苗脯氨酸含量的测定 接种根结线虫30 d后，称取0.2 g黄瓜叶片，放入研钵，加入5 mL 3%（ω）磺基水杨酸溶液研磨成匀浆，把匀浆全部转移到离心管中，沸水浴浸提10 min，冷却后以 3 000 r·min-1离心 10 min，吸取上清液 2 mL，加 2 mL冰乙酸和3 mL显色液，于沸水浴中加热40 min，取出离心冷却后各管加入5 mL甲苯，充分震荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以空白对照在波长520 nm下比色，从标准曲线查出测定液中脯氨酸含量[15]。

1.4.4 黄瓜幼苗抗氧化保护酶活力的测定 接种根结线虫30 d后，称取0.5 g叶片放入研钵中，加2 mL 0.05 mol·L-1、pH=7.8 的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10 mL离心管中，再加3 mL磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20 min（若做可溶性蛋白，转速为4 000 r·min-1，若不做，则10 000 r·min-1），上清液（酶液）倒入试管中，置于 0～4℃下保存待用[16]。过氧化物酶（POD）的活性参照朱广廉[17]的方法测定，多酚氧化酶（PPO）的活性参照李靖等[18]的方法测定，苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性参照薛应龙[19]的方法测定，超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用 NBT法[20]，过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外吸收法测定[21]。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 17.0选择Duncan多重极差法进行差异显著性分析，采用Origen 8.0软件作图分析。

2 结果与分析

2.1 发酵滤液对黄瓜叶片丙二醛含量的影响

发酵滤液对黄瓜叶片丙二醛含量的影响如表1所示。接种根结线虫对黄瓜叶片丙二醛含量有增加效应，对照中A组比B组增加17.33%;丙二醛含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，膜质受害越严重丙二醛含量越高，而发酵滤液对丙二醛含量有抑制作用，尤其在受根结线虫危害时，效果更为明显，10、20 mg·mL-1发酵滤液降低丙二醛含量分别达到23.53%、22.99%。发酵滤液可有效缓解根结线虫对黄瓜的毒害作用。

表1 不同浓度发酵滤液对黄瓜叶片丙二醛含量的影响 （μmol·g-1）

2.2 发酵滤液对黄瓜叶片脯氨酸含量的影响

经不同发酵液处理后，黄瓜叶片脯氨酸含量变化如表2所示。在根结线虫胁迫条件下脯氨酸的含量显著增加22.93%；发酵滤液对脯氨酸含量有明显抑制作用，未接线虫而加入不同浓度发酵液的黄瓜植株脯氨酸含量分别比对照降低了28.93%、31.58%、16.96%、49.14%，接线虫组脯氨酸含量分别比对照降低了23.91%、10.93%、30.59%、、21.74%、40.15%，可能是发酵滤液的加入改善植物生长的环境，进而促进植物的生长。施用发酵液的黄瓜植株脯氨酸含量都显著降低，A组、B组变化趋势一致。

2.3 保护酶活力的变化

表2 不同浓度发酵滤液对黄瓜叶片脯氨酸含量的影响ω/（μg·g-1）

2.3.1 发酵滤液对黄瓜幼苗叶片SOD比活力的影响 SOD是植物体内清除自由基的关键酶，可以清除植物体内因受害而产生的氧自由基，因此植物受害时酶活力升高，危害缓解时酶活力降低或没有变化[22]。试验结果显示，染病黄瓜SOD的比活力（以蛋白质计）（50.34 IU·mg-1）比对照（41.74 IU·mg-1）增加20.61%，酶活力增强可清除自由基，进而减轻植物损伤。接线虫组施用10 mg·mL-1发酵滤液对SOD比活力有显著的增强作用，说明在特定浓度下发酵滤液能够缓解根结线虫对黄瓜植株的侵害。发酵滤液对接线虫组SOD活性的影响趋势表现为先增强后减弱，说明浓度是防治线虫的关键因素，要选择合适的浓度才能有效防治线虫。未受线虫感染组SOD活性随施用浓度的增加呈现上升的趋势，表示发酵滤液有利于提高黄瓜植株抗性，对植物有保护作用（图1a）。

2.3.2 发酵滤液对黄瓜幼苗叶片POD比活力的影响 黄瓜植株受到根结线虫危害时POD比活力降低，POD活性降低能够增加H2O2积累，H2O2能够杀死侵入植物细胞的根结线虫，增强植物对根结线虫的抗性（图1b）。未受线虫侵染组，发酵滤液显著降低了植株 POD 比活力（对照：427.52 IU·mg-1），分别降低38.79%、41.41%、48.26%、31.98%，说明发酵滤液对POD活性有抑制作用。

图1 不同浓度发酵滤液对黄瓜叶片SOD（a）和POD（b）比活力的影响

2.3.3 发酵滤液对黄瓜幼苗叶片CAT比活力的影响 CAT参与活性氧的代谢过程，可清除体内过氧化氢，使细胞免受H2O2的毒害。如图2所示，根结线虫对CAT比活力有抑制作用（比清水对照降低了49.28%），和POD一样，CAT比活力的降低使得植物体内保持较高的活性氧水平，从而对线虫产生毒害作用，杀死入侵线虫。接线虫组发酵滤液对CAT比活力有显著的增加作用，分别比对照增加42.75%、19.05%、89.97%、73.01%，同样是发酵滤液使CAT活性升到较高水平甚至是正常水平。未受线虫感染组的CAT比活力在加入5、10、40 mg·mL-1发酵液时都显示被抑制，在加入20 mg·mL-1发酵液时CAT比活力（18.36IU·mg-1）高于对照（16.93IU·mg-1）8.32%，发酵滤液对植株CAT活性作用比较复杂，合适的浓度才有利于加强植物的防御系统。

图2 不同浓度发酵滤液对黄瓜叶片CAT比活力的影响

2.3.4 发酵滤液对黄瓜幼苗叶片PAL比活力的影响 PAL是植物苯丙烷类代谢的关键酶，当细胞受侵时能促进抗菌物质和细胞结构屏障物质合成，减轻植物病害。如图3a所示，根结线虫对PAL比活力有降低的作用（降低了27.96%）；施用发酵滤液能够显著提高 PAL 比活力（对照：0.72 IU·mg-1），有利于增强黄瓜植株对根结线虫的抗性，随着发酵滤液浓度的增加，增强效应逐渐减弱（试验组：0.92、0.92、0.88、0.84 IU·mg-1）；未受线虫感染组施用发酵滤液对PAL比活力有显著的降低效应（对照：0.99 IU·mg-1），且随着浓度的增加效果越显著（试验组：0.88、0.83、0.79、0.89 IU·mg-1）。

图3 不同浓度发酵滤液对黄瓜叶片PAL（a）及PPO（b）比活力的影响

2.3.5 发酵滤液对黄瓜幼苗叶片PPO比活力的影响 PPO是酚类物质氧化的主要酶，其活性与植物抗病性密切相关，活性高说明抗性越高。未受根结线虫感染组发酵滤液对黄瓜叶片PPO比活力有显著的抑制作用，比对照（2.29 IU·mg-1）分别降低了18.95%、46.81%、55.44%、29.04%，作用效果随着施用浓度的增加愈加明显。黄瓜受根结线虫侵害时，发酵滤液显著增强了黄瓜叶片PPO比活力，比对照（0.88 IU·mg-1）分别增加 84.09%、65.09%、92.54%、68.19%，清水对照组植物受害相当严重，施用发酵滤液明显缓解了根结线虫对植物的侵害，提高了植株对根结线虫的抗性（图3b），这与SOD、POD、CAT和PAL表现趋势类似。

3 讨论

丙二醛（MDA）是膜质被氧化的产物，MDA含量可以作为细胞膜受害程度和植物抗病评价标准[23]。试验结果显示不同浓度发酵滤液均可降低MDA含量，对根结线虫的危害起到缓解作用。脯氨酸是重要的渗透调节物质，在植物抗逆过程中可以维持原生质体与环境的渗透平衡[24]，可以作为植物抗逆性的生理指标。健康植株游离脯氨酸含量较低，植株受到胁迫后脯氨酸活力升高，以提高细胞渗透势。发酵滤液能够降低脯氨酸含量，可能是在一定程度内改善了植物生长的环境。

SOD、POD和CAT都与植物体内O2-的代谢有关，它们相互协调作用以维持植物体内O2-的正常水平，避免因过多氧自由基的存在而使植物受害。黄瓜受根结线虫浸染，POD、CAT比活力均下降，植物体内的超氧阴离子不断积累，对线虫产生毒害作用，减轻线虫对植物的损害。施用发酵滤液后，对根结线虫产生毒害作用，减轻了线虫对植株的侵染，致使POD比活力增强，可能是其在土壤中杀死根结线虫，减轻其对黄瓜植株的侵染，降低了H2O2含量，起到保护植物的目的。SOD和CAT活性增强，且随着施用发酵滤液浓度的增加，防御酶的比活力呈上升的趋势，说明发酵滤液可提高植物的抗性，对植物起到了保护的作用。根结线虫侵染黄瓜植株，PAL比活力下降，施用发酵滤液能够提高PAL比活力，对根结线虫表现出显著的抑制作用。同样，PPO活力与PAL活力表现出一致性，都是通过提高防御酶的活力来提高植株对根结线虫的抗性。BH0531发酵滤液通过提高保护酶的活性来防治根结线虫对植株的侵害，至于该菌是通过何种机制来影响保护酶活力进而实现杀线虫作用的，还有待深入研究。