HPLC-ELSD法测定西藏林芝地区野生瓦布贝母中3种生物碱的含量

林丽君，钟燕珠，雷旭，区炳雄，林华（.深圳市罗湖区中医院，广东 深圳 5800；.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州500）

HPLC-ELSD法测定西藏林芝地区野生瓦布贝母中3种生物碱的含量

林丽君1，钟燕珠2，雷旭2，区炳雄2，林华2
（1.深圳市罗湖区中医院，广东 深圳 518001；2.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州510120）

目的以贝母辛、西贝母碱、贝母素乙3种生物碱成分为指标，考察西藏林芝地区不同产地野生瓦布贝母的品质情况，为今后林芝地区川贝母人工种植种质选育奠定实验基础。方法采用HPLC-ELSD法，色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%（体积分数）二乙胺（体积比70∶30），流速为1.0 mL/min，检测器为蒸发光散射检测器。结果林芝地区6批野生瓦布贝母中的贝母辛、西贝母碱和贝母素乙质量分数分别是川贝母对照药材的1.79～2.70倍、2.13～3.64倍和1.88～2.37倍。结论林芝地区的野生瓦布贝母品质较好，可作为人工种植育种的种质来源。

林芝地区；瓦布贝母；生物碱

川贝母为百合科（Liliaceae）贝母属（Fritillaria）川贝母等6种植物的干燥鳞茎，为清热润肺、祛痰止咳良药，供临床配方和中成药生产，需求量巨大，但药材来源所依赖的野生资源严重不足，供需矛盾日益突出，价格迅速攀升。对川贝母野生药材的过度采收已导致其资源日渐枯竭，现已被列入国家3级保护植物名单。为缓解供需矛盾和有效保护野生资源，药学工作者在人工种植川贝母方面做了较多有益的探索［1-2］。经笔者对西藏林芝地区实地调研发现，该地区有一定量的野生川贝母（瓦布贝母）分布，表明其具备种植川贝母的地理环境和气候。瓦布贝母是自2010年版《中国药典》开始新增收的川贝母来源之一，且总生物碱质量分数较高［3］。现代研究表明，川贝母中主要活性成分生物碱类化合物药理作用广泛，其中西贝母碱在贝母类生物碱中止咳作用最强［4-5］，因此笔者以川贝母生物碱类成分中共有的、具代表性的有效成分贝母辛、西贝母碱、贝母素乙质量分数为评价指标，采用 HPLC-ELSD法［6-8］考察林芝市不同县区野生瓦布贝母的品质，为其能否作为人工种植种质选育来源提供试验依据。

1　仪器与试药

1.1仪器

LC-20AT Prominence高效液相色谱仪，包括LC-20AT二元泵、SIL-20A自动进样器、Varian380-LC蒸发光散射检测器、LCsolution色谱工作站（日本岛津公司），Sartorius CP225D分析天平（德国赛多利斯公司，十万分之一），SG8200HE型超声清洗仪（上海冠特超声仪器有限公司，频率40 kHz、功率600 W）。

1.2试药

川贝母对照药材（批号121000-201108、中国食品药品检定研究院），西贝母碱对照品（批号X-021-150320、质量分数＞98%、成都瑞芬思生物科技有限公司），贝母辛对照品（批号111892-201402、质量分数＞99.9%、中国食品药品检定研究院），贝母素乙对照品（批号PD151113-04、质量分数＞99.9%、Stanford Analytical Chemicals Inc），乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。

实验所用1号样品为从中国食品药品检定研究院购得的川贝母对照药材，2～7号川贝母样品采自西藏林芝市不同县区，由笔者亲自或委托他人向当地药农收购，经广州中医药大学谭树辉副教授鉴定为瓦布贝母 Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C. Hsia var.wabuensis（S.Y.Tang et S.C.Yue）Z.D. Liu，S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎，8～10号样品由药材生产加工企业提供，经谭树辉副教授鉴定为川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don的干燥鳞茎。样品详细信息见表1。

表1　川贝母对照药材及9批样品的详细信息表Table 1 The detailed information table of reference Bulbus F. Cirrhosae and 9 batches of samples

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱:Welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相:乙腈-0.1%（体积分数）二乙胺（体积比70∶30），流速:1.0 mL/min，柱温:30℃；采用ELSD检测，漂移管温度:45℃，载气压力:1.65× 105Pa，进样量:20 μL，以贝母辛质量分数计算理论塔板数不低于2 000。在上述色谱条件下，混合对照品储备液、对照药材溶液、供试品溶液中的贝母辛、西贝母碱和贝母素乙均能得到良好分离。见图1。

2.2混合对照品储备液的制备

分别精密称取贝母辛、西贝母碱和贝母素乙对照品9.90、9.92、9.95 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.198 0、0.198 4、0.199 0 mg/mL的混合对照品储备液。

2.3供试品、对照药材溶液的制备

将表1中瓦布贝母和企业提供的川贝母样品粉碎过80目筛，分别取2 g，精密称定，置于50 mL离心管中，加浓氨水4 mL浸润1 h，加入三氯甲烷-甲醇（体积比4∶1）混合液40 mL，超声1 h，4 400 r/min离心10 min，除去氨水后滤过。滤液转移至蒸发皿中蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，作为供试品溶液。取川贝母对照药材2 g，精密称定，按上述方法制备对照药材溶液。

图1　混合对照品（A）、川贝母对照药材（B）与瓦布贝母供试品（C）溶液的HPLC-ELSD色谱图Figure 1 The HPLC-ELSD chromatogram of mixed reference substances（A），Bulbus F.Cirrhosae（B）and Bulbus Fritillariae wabuensis（C）

2.4线性关系的考察

分别精密量取混合对照品储备液0.4、0.8、1.2、1.8、3.0、6.0 mL，置10 mL容量瓶中，分别补加甲醇至10.0 mL，制得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取各质量浓度混合对照品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定并记录峰面积。以峰面积的对数（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，分别得到贝母辛、西贝母碱、贝母素乙的回归方程:Y1=1.262 4X1+13.827 2，r1=0.999 9；Y2=1.275 5X2+13.548 2，r2=0.999 9；Y3=1.303 3X3+13.367 6，r3= 0.999 6。结果表明，三者分别在7.920～118.800、7.936～119.040、7.960～119.400 μg/mL范围内与峰面积的对数呈良好线性关系。

2.5精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液（贝母辛、西贝母碱和贝母素乙质量浓度分别为23.760、23.808、 23.880 μg/mL）20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定各成分的峰面积，连续测定6次，得贝母辛、西贝母碱和贝母素乙峰面积的RSD值分别为0.93%、0.87%、1.04%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验

精密吸取2号供试品溶液20 μL，分别于制备0、2、4、8、12、24 h后按“2.1”项下色谱条件测定各成分峰面积，结果得贝母辛、西贝母碱和贝母素乙峰面积的RSD值分别为1.72%、1.22%、1.51%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7重复性试验

取2号瓦布贝母供试品6份，每份2 g，精密称定，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定各成分峰面积，计算其质量分数。结果样品中贝母辛、西贝母碱和贝母素乙三者的平均质量分数和 RSD值分别为0.015 9%、1.37%，0.027 6%、1.10%，0.015 4%、1.62%（n=6），表明方法重复性良好。

2.8加样回收率试验

取已知贝母辛、西贝母碱和贝母素乙3种生物碱质量分数（分别为0.015 9%、0.015 1%、0.015 4%）的2号供试品6份，每份2 g，精密称定，分别精密加入3种生物碱对照品适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率。结果见表2～表4。

2.9样品的测定

分别取表1中川贝母对照药材及9批样品2 g，精密称定，分别按取“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定贝母辛、西贝母碱和贝母素乙的峰面积，计算其质量分数。结果见表5。

表2　瓦布贝母中贝母辛的回收率试验结果Table 2 　Recovery results of peimisine in wild Bulbus F. wabuensis（n=6）

表3　瓦布贝母中西贝母碱的回收率试验结果Table 3 　Recovery results of sipeimine in wild Bulbus F.wabuensis（n=6）

表4　瓦布贝母中贝母素乙的回收率试验结果Table 4 Recovery results of peiminine of wild Bulbus F.wabuensis（n=6）

表5　川贝母对照药材及9批样品中3种生物碱的质量分数Table 5 　Determination results of three alkaloids in the reference of Bulbus F.Cirrhosae and 9 batches of samples （s，n=3）　w/%

表5　川贝母对照药材及9批样品中3种生物碱的质量分数Table 5 　Determination results of three alkaloids in the reference of Bulbus F.Cirrhosae and 9 batches of samples （s，n=3）　w/%

样品编号　　贝母辛　　西贝母碱　　贝母素乙1　0.008 7±0.000 2 0.006 9±0.000 2　0.008 2±0.000 2 2　0.015 9±0.000 3 0.015 1±0.000 2　0.015 4±0.000 3 3　0.015 6±0.000 3 0.014 7±0.000 1　0.015 7±0.000 3 4　0.020 4±0.000 2 0.019 5±0.000 4　0.017 5±0.000 3 5　0.021 1±0.000 4 0.020 8±0.000 3　0.017 7±0.000 2 6　0.023 5±0.000 3 0.025 1±0.000 4　0.019 4±0.000 4 7　0.019 9±0.000 3 0.022 1±0.000 3　0.019 1±0.000 3 8　0.006 9±0.000 3 0.005 7±0.000 2　0.007 6±0.000 1 9　0.006 5±0.000 3 0.005 6±0.000 1　0.007 3±0.000 2 10　0.007 3±0.000 2 0.006 2±0.000 2　0.007 7±0.000 1

3　讨论

6批西藏林芝地区野生瓦布贝母中贝母辛、西贝母碱和贝母素乙的质量分数均高于川贝母对照药材，分别是其1.79～2.70倍、2.13～3.64倍和1.88～2.37倍，其中采自巴宜区的6号样品中3种生物碱的质量分数均最高。

在对林芝地区野生瓦布贝母进行质量考察的同时，笔者随机选择了广东3家药材生产加工企业的川贝母药材进行对比研究，其贝母辛、西贝母碱和贝母素乙质量分数均低于川贝母对照药材，并远低于林芝地区产瓦布贝母，均在其相应值的50%以下。

瓦布贝母与川贝母的优质来源品种暗紫贝母亲缘关系很近［9］，且植株更高大，有利于其主要活性物质、次生代谢产物生物碱类成分的积累。西藏林芝地区野生瓦布贝母中3种生物碱质量分数测定结果与对照药材、3家企业产品相应值相比较的结果表明前者品质较好，提示可从中筛选优质高产的瓦布贝母品种，作为开展人工种植育种的种质来源。

［1］向丽，韩建萍，陈士林.人工栽培川贝母种苗质量标准研究［J］.环球中医药，2011，4（2）:91-94.

［2］邓小红，侯盛昌.川贝母栽培技术初步研究［J］.四川林业科技，2014，35（3）:54-58.

［3］张培培，周勤梅，秦波，等.川贝母栽培品瓦布贝母与松贝母的总生物碱对比研究［J］.成都中医药大学学报，2011，34（1）:70-72.

［4］颜晓燕，彭成.川贝母药理作用研究进展［J］.中国药房，2011，22（31）:2963-2965.

［5］CHAN Shunwan.高效液相色谱-蒸发光散射检测测定川贝母中主要镇咳生物活性成分西贝母碱及其在鼠体内药代动力学研究［J］.国外分析仪器，2001（4）:47-48.

［6］黄林芳，陈士林，刘辉，等.HPLC-ELSD测定不同加工方法川贝母中3种生物碱［J］.中成药，2009，31（10）: 1560-1564.

［7］刘晶，王曙，辛贵忠，等.HPLC-ELSD测定太白贝母和瓦布贝母中贝母辛的含量［J］.中国药学杂志，2010，45 （13）:1032-1034.

［8］刘薇，张文娟，穆显隆，等.中药川贝母质量控制方法研究［J］.亚太传统医药，2015，11（2）:41-46.

［9］毛艳苹，赵高琼，苏玉萍，等.川产贝母新资源瓦布贝母研究进展［J］.中药与临床，2014，5（3）:53-55.

（责任编辑：刘晓涵）

Determination on three alkaloids of wild Bulbus Fritillariae wabuensis in Nyingchi Prefecture of Tibet by HPLC-ELSD

LIN Lijun1，ZHONG Yanzhu2，LEI Xu2，OU Bingxiong2，LIN Hua2
（1.Shenzhen Luohu District Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518001，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China）

Objective To investigate the general quality of wild Bulbus Fritillariae wabuensis from different places of origin in Nyingchi Prefecture，Tibet Autonomous Region，with three alkaloids′contents as the indicator，in order to lay the experimental basis for germplasm selection and breeding of future artificial cultivation of F.wabuensis in Nyingchi Prefecture.Methods A high performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detector was employed upon an Welch Ultimate AQ-C18column （4.6 mm×250 mm，5 μm），with acetonitrile-water containing 0.1%diethylamine（70∶30）as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min.Results The contents of peimisine，sipeimine，peiminine in wild Bulbus F.wabuensis from Nyingchi Prefecture were 1.79 to 2.70 times，2.13 to 3.64 times，1.88 to 2.37 times more than those in the reference of Bulbus Fritillariae Cirrhosae.Conclusion Wild Bulbus F. wabuensis from Nyingchi Prefecture of Tibet could be used as a source of germplasm for breeding in artificial cultivation.

Nyingchi Prefecture；F.wabuensis；alkaloids

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0458-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016053102

2016-05-31

广东省科技基础条件建设项目（2013B060400021）

林丽君（1981—），女，学士，主管中药师，主要从事中药鉴别研究，电话:0755-82311633，Email:11512900@qq.com；通信作者:钟燕珠（1976—），女，硕士，主任中药师，主要从事中药真伪优劣品质评价研究，电话:020-81887233-36702，Email:duduzyz@sohu.com。

网络出版时间:2016-07-011 15:00 网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1500.007.html