Surfactin抑菌稳定性及其在米饭和面包中的应用

汪水呈,曾维伟,陆兆新

(南京农业大学食品科学技术学院,江苏南京 210095)



Surfactin抑菌稳定性及其在米饭和面包中的应用

汪水呈,曾维伟,陆兆新*

(南京农业大学食品科学技术学院,江苏南京 210095)

本文研究了温度、pH、紫外、糖、盐对Surfatin抑菌效果的影响以及其在米饭和面包中的初步应用。结果表明:在弱酸性条件下,Surfatin的抑菌活性随温度变化不大,pH6,100 ℃处理20 min,对藤黄微球菌的抑菌圈由17.52±0.22 mm变为16.44±0.03 mm;而在碱性条件下,高温处理使其严重失活,在pH8,60℃处理20 min,抑菌圈由15.75±0.19 mm减小到12.69±0.26 mm,且90 ℃便使其完全失活;紫外会降低Surfactin抑菌活性,但效果不明显;糖、盐对其抑菌效果无显著性影响;在pH大于5.5的食品中,防腐保鲜效果优于Nisin,在米饭中加入适量的Surfactin,可将保质期延长24 h,在面包中适宜添加量为200～500 mg/kg。

Surfactin,抑菌稳定性,防腐保鲜

Surfactin是由革兰氏阳性芽孢杆菌通过非核糖体合成途径产生的具有抗菌作用的脂肽类化合物,中文名称为表面活性素。它具有广谱、高效、安全无毒、不易产生耐药性、易被生物降解等优点[1]。由于生物性抗菌肽类防腐剂符合安全、高效、低残留、生态的新型防腐剂要求,目前逐渐成为了开发新型食品防腐添加剂的研究亮点[2-3]。Surfactin的抗菌活性能有效控制食品中有害微生物的滋生,可作为生物防腐剂应用在食品防腐保鲜领域[4],主要包括乳制品[5]、肉制品[6-7]等,由于不同结构的抗菌脂肽其物理化学性质,如表面活性、最适pH和对热的稳定性等不同,这也就决定其功能和应用领域。目前,对Surfactin的研究主要集中在其性质与原油开采和环境治理方面[8],关于其抗菌性在食品中的应用报道不多。因此,对Surfactin抑菌性等相关性质研究对于今后的应用有着重要的意义。本文研究了其对pH、温度、紫外、糖、盐的抑菌稳定性,同时对其在米饭和面包中的应用进行了初步的实验,为其在食品行业中潜在的应用价值提供了参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

藤黄微球菌:CMCC 28001

素琼脂:2%琼脂,121 ℃灭菌20 min后待用

S1培养基:胰蛋白胨:0.8%;酵母膏:0.5%;葡萄糖:0.5%;氯化钠:0.5%;磷酸氢二钠:0.2%;琼脂1.6%,121 ℃灭菌20 min后待用

牛津杯:(内径6 mm、外径7.8 mm、高10 mm)

Surfactin样品(90%纯度,淀粉液化芽孢杆菌发酵生产及分离纯化制得[7]);Nisin:浙江银象生物工程有限公司;包装:聚乙烯袋。东北大米、高筋面粉、盐、鸡蛋、白砂糖、酵母粉、奶粉、奶油超市购买。

超净工作台SW-CJ-1FD苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS-50X65上海跃进医疗器械厂;全自动灭菌锅SX-700日本TOMY公司;层次炉附属醒发箱SEC-2Y-P广州三麦机械设备有限公司;面团搅拌机SC-10L广州三麦机械设备有限公司;电饭煲美的公司。

1.2实验方法

1.2.1Surfactin抑菌效价测定采用牛津杯双层琼脂法[9]:将灭菌后的2%素琼脂,倒入无菌平板中,待其冷却后摆放灭菌牛津杯。将灭菌后的S1培养基冷却至50 ℃左右,接入藤黄微球菌(106～107cfu/mL的S1液体培养基),混合均匀,倾注平板,待其凝固后取出牛津杯,吸取100 μL 1 mg/mL pH为7的Surfactin水溶液至孔内,37 ℃培养12 h,用游标卡尺测量抑菌圈直径。

Nisin标准曲线绘制:准确称取适量Nisin,用0.02 mol/L的盐酸溶解,分别配制成8000、4000、2000、1000、500、250、100、50 IU/mL。用1.2.1中牛津杯法测定抑菌圈直径。

1.2.2pH对Surfactin抑菌活性的影响用酸碱溶液调节蒸馏水的pH至6、6.5、7、7.5、8,分别用其溶解Surfactin,使其浓度为1 mg/mL,用1.2.1中牛津杯法测定抑菌圈直径。

1.2.3温度对Surfactin抑菌活性的影响将配制好的不同pH的Surfactin水溶液,在不同温度(60、70、80、90、100 ℃)下处理20 min,用1.2.1中牛津杯法测定抑菌圈直径。

1.2.4紫外对Surfactin抑菌活性的影响吸取适量的1 mg/mL Surfactin水溶液(pH7),置于开盖无菌玻璃平板中进行紫外线照射处理(18W 紫外灯,35 cm),时间分别为0、5、10、20、30、45、60 min。用1.2.1中牛津杯法测定抑菌圈直径。

1.2.5蔗糖对Surfactin抑菌活性的影响分别配制0%、5%、10%、20%、30%、40%的蔗糖溶液,调节至pH7,取蔗糖溶液溶解Surfactin,使其浓度为1 mg/mL。用1.2.1中牛津杯法测定抑菌圈直径。

1.2.6盐对Surfactin抑菌稳定的影响分别配制0%、1%、3%、5%、7%、9%的氯化钠溶液,调节至pH=7,取氯化钠溶液溶解Surfactin,使其浓度为1 mg/mL。用1.2.1中牛津杯法测定抑菌圈直径。

1.2.7Surfactin在米饭、面包中的应用分别参考杨云斌[10]和黄巍峰[11]的方法,制作米饭和面包,在包装前以无菌操作均匀喷洒0.005%、0.02%、0.05%的Surfactin水溶液,以0.02%的Nisin作为阳性对照,无菌蒸馏水作为阴性对照,将以上经过处理的米饭和面包放置于25 ℃储藏。米饭分别在0、12、24、36、48、60、72 h取样,面包分别在0、1、3、5、7、9 d取样,米饭测定指标为菌落总数[12]与感官评定[12],面包测定指标为菌落总数[13]、滴定酸度[14]、感官评定[14]。产品变质的标准为感官没有异常,且微生物及理化指标在相关国家标准范围内。保质期为开始保藏到相应指标超过相应国家标准的时间间隔。

米饭制作过程:大米→水淘洗→水浸泡20 min→电饭锅煮20 min→冷却→均匀喷洒防腐剂→包装

面包制作过程:称料→和面→基础发酵→面团松弛→中间醒发→成型发酵→焙烤→冷却→均匀喷洒防腐剂→包装

注:用无菌玻璃喷雾器将相应防腐剂均匀喷洒在样品表面,米饭在喷洒后搅拌均匀。

1.3数据处理

使用SPSS Statistics 19软件进行多重比较分析,利用Excel 2013软件进行数据处理与绘图。

2　结果与分析

2.1Surfactin的效价

Nisin标准曲线如图1所示。

图1　Nisin标准曲线Fig.1　The standard curve of Nisin注:指示菌为藤黄微球菌。

1 mg/mL pH为7的Surfactin水溶液对藤黄微球菌的抑菌圈大小为16.76±0.06 mm,代入方程计算出其效价为1884.702±72.407 IU/mg,即为Nisin的1.88倍左右。

2.2pH对Surfactin抑菌活性的影响

在pH6以下,Surfactin的水溶液会产生絮状沉淀。因此选择pH>6的环境中研究其抑菌稳定性,而从图2可以看出,在pH6～pH8的范围内,随着pH的升高,Surfactin的抑菌效果有所下降(p<0.05),但在中性及弱酸性环境中,下降不明显。因此,在后期的食品应用中,应选择pH为6～7的食品,以发挥Surfactin的最大抑菌效果。

图2　pH对Surfactin抑菌活性的影响Fig.2　Effect of pH on antimicrobial activity of Surfactin注：标注不同字母表示差异显著p<0.05，图4同。

2.3温度对Surfactin抑菌活性的影响

如图3所示,温度和pH对Surfactin的抑菌活性有影响。随着处理温度的升高,其抑菌圈在不断减小,随着pH的增高,温度对抑菌效果的影响越来越大。在pH6时,90 ℃以下,抑菌效果几乎没有发生变化(p>0.05)。之后随着温度升高,抑菌效果下降也不明显。而在pH8时,60 ℃就使抑菌圈从15.75±0.19 mm减小到12.69±0.26 mm,在90 ℃时,已经完全丧失了抑菌活性,这可能是因为高温处理会造成Surfactin胶束结构破坏[15]。总的来说,在弱酸性的条件下,Surfactin抑菌活性随温度变化不大,而在弱碱性的条件下,高温处理使其活性损失严重,即酸性环境下有利于保护Surfactin的抑菌活性。这与熊玲[16]报道的结果相同。

图3　温度对Surfactin抑菌活性的影响Fig.3　Effect of tempareture on antimicrobial activity of Surfactin注:C为对照组,未进行高温处理。

2.4紫外线对Surfactin抑菌活性的影响

由图4可知,抑菌圈直径在16.98～15.69 mm范围内。随着紫外照射时间的增加,其抑菌活性逐渐下降(p<0.05)。但在紫外处理60 min后,抑菌活性为对照的92.4%,因此可以认为紫外线处理对Surfactin的抑菌活性有一定影响，但影响不大。

图4　紫外对Surfactin抑菌活性的影响Fig.4　Effect of ultraviolet radiation on antimicrobial activity of Surfactin

2.5蔗糖对Surfactin抑菌活性的影响

由图5看出,随着糖浓度的增加,Surfactin的抑菌圈逐渐变大,由开始的16.74 mm增加到17.45 mm,但变化不明显(p>0.05)。抑菌活性增加可能是由于蔗糖的存在改变了微生物生长环境的渗透压,在一定程度上增强了Surfactin的抑制活性。

图5　蔗糖对Surfactin抑菌活性的影响Fig.5　Effect of sucrose on antimicrobial activity of Surfactin

2.6盐对Surfactin抑菌活性的影响

由图6可知,随着盐浓度的变化,Surfactin的抑菌浓度在16.36～16.82 mm之间波动,但变化幅度不大。由此可见,Surfactin对盐有较高的稳定性,基本不受到盐浓度的影响(p>0.05)。这与戴超[17]等的研究报道的结果相同。

图6　盐对Surfactin抑菌活性的影响Fig.6　Effect of salt on antimicrobial activity of Surfactin

2.7Surfactin在米饭、面包中的应用

2.7.1不同防腐剂对米饭保藏过程中感官质量的影响表1显示的是25 ℃保藏过程中米饭感官质量的变化情况,对照组米饭感官质量下降最快。在24 h就出现了异味。在保藏期间,随着Surfactin浓度的增加,米饭感官质量下降减缓。500 mg/kg的处理组到60 h才出现异味,是对照组时间的2.5倍。相同剂量的Surfactin与Nisin相比,出现异味的时间由36 h延长至48 h。

表1　25℃保藏过程中米饭感官质量的变化

注:C代表对照;N代表Nisin;S代表Surfactin。

表2　25℃保藏过程中米饭菌落总数的变化

注:C代表对照;N代表Nisin;S代表Surfactin;数据单位为log cfu/g,-表示菌落总数多不可记;采用邓肯多重比较法分析,同一行不同字母表示显著性差异(p<0.05),表3同。

表3　25 ℃保藏过程中面包菌落总数的变化

2.7.2不同防腐剂对米饭保藏过程中米饭菌落总数的影响从表2可以看出,Surfactin对微生物抑制作用明显(p<0.05)。随着保藏时间的增加,各实验组米饭菌落总数均增加,对照组增加最快,其次分别为低剂量Surfactin组、Nisin组、中剂量Surfactin组和高剂量Surfactin组。剂量相同的Surfactin组抑菌效果略好于Nisin组。对照组在24 h左右就发生了变质,放置48 h时,其菌落总数已超过了国家标准[12]中的最高安全限量(log cfu/g≤5),而此时添加中、高剂量的Surfactin菌落总数的对数为3.90和3.46。就微生物标准而言,高剂量Surfactin组将保存期从48 h延长至72 h。菌落总数的变化和感官质量变化基本保持一致。

2.7.3不同防腐剂对面包保藏过程中感官质量的影响实验结果表明,对照组与处理组在感官质量方面并无明显差别。

2.7.4不同防腐剂对面包保藏过程中菌落总数的影响从表3可以看出,Surfactin能有效抑制微生物的生长(p<0.05)。随着保藏时间的增加,各实验组面包菌落总数均增加,对照组增加最快,其次分别为低剂量Surfactin组、Nisin组、中剂量Surfactin组和高剂量Surfactin组。对照组在25 ℃下放置3 d,其菌落总数已超过了国家标准[13](log cfu/g≤3.176),而此时添加中、高剂量的Surfactin菌落总数的对数为1.67和1.56,远低于国家标准[13]。剂量相同的Surfactin组抑菌效果明显高于Nisin组,相对于对照组,中高剂量Surfactin组将保存期从3 d延长至7 d。

2.7.5不同防腐剂对面包保藏过程中米饭菌落总数的影响从表4的结果来看,面包在储藏前期,总体来说酸度有细微增加,但增加幅度不大(p>0.05)。加入Surfactin的实验组酸度增加的速率小于对照组,且随着剂量增加,酸度增加速率越小。说明Surfactin可以延缓面包在存储过程中酸度的增加。所有处理组的酸度均未超过国家标准[14](≤6 °T)。

3　结论

低pH会使溶液产生絮状沉淀,在pH6～pH8的范围内,随着pH的升高,抑菌圈大小略有下降。糖和盐含量对Surfactin抑菌效果影响不大,因此其可以用于盐、糖含量高的食品中。Surfatin对紫外不是非常敏感,但20 min以上抑菌效果会出现一定的下降,因此在应用时应考虑紫外照射对Surfactin的影响。温度对Surfactin抑菌活性影响较大,碱性条件下,随着温度的升高,Surfactin抑菌效果下降明显,而在弱酸性条件下,100 ℃内,抑菌活性基本保持不变。Surfactin抑菌效价是Nisin的1.88倍,在pH呈弱酸性的食品中具有一定的应用前景。

表4　25 ℃保藏过程中面包滴定酸度的变化(°T)

注:C代表对照;N代表Nisin;S代表Surfactin;数据单位为°T;采用邓肯多重比较法分析,同一行不同字母表示显著性差异(p<0.05)。

米饭防腐应用中,综合感官质量和菌落总数考虑,Surfactin保鲜效果好于Nisin。与对照相比,以微生物指标为标准,加入适量的Surfactin可以将保质期由48 h延长至72 h。面包防腐应用中,Surfactin保鲜效果依然好于Nisin。与对照相比,加入适量的Surfactin可以将保质期由3 d延长至7 d。从菌落总数的结果来看,面包中Surfactin适宜添加量为200～500 mg/kg。

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Study on antimicrobial stability and application of Surfactin in food

WANG Shui-cheng,ZENG Wei-wei,LU Zhao-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

The effects of temperature,ultraviolet,pH,salts and sucrose on biological stability of Surfactin were investigated. The results showed that in weakly acidic solutions,the antibacterial activity of Surfactin changed little with temperature. After being processed under pH6,100 ℃ for 20 min,the diameter of the inhibition zone for Micrococcus luteus was varied from 17.52±0.22 mm to 16.44±0.03 mm. While Surfactin was processed in the alkaline(pH8)at 60 ℃ for 20 min,which can highly inhibit its bioactivity,the diameter of the inhibition zone was varied from 15.75±0.19 mm to 12.69±0.26 mm. It completely lost activity after treatment of pH8,90 ℃. Ultraviolet inhibited the antibacterial activity,but the effect was not obvious,while sucrose and salt had no significant influence. The preservative experiment results showed that the effect of Surfatin was much better than Nisin in foods whose pH was higher than 5.5. Adding an appropriate amount of Surfactin the rice might extend the shelf life of 24 h and the suitable dosage of Surfactin for bread was 200～500 mg/kg.

Surfactin;antibacterial stability;anticorrosion and preservation

2015-12-16

汪水呈(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:2013108005@njau.edu.cn。

陆兆新(1957-)，男，博士，教授，研究方向：酶工程和食品生物技术，E-mail：fmb@njau.edu.cn。

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD23B05)。

TS202

A

1002-0306(2016)13-0257-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.044