乳杆菌代谢所产生的抑酵母活性物质的分离纯化

陈忠军,高鹤尘,李海瑄,郑中文,赵　洁

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)



乳杆菌代谢所产生的抑酵母活性物质的分离纯化

陈忠军,高鹤尘,李海瑄,郑中文,赵洁

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

从内蒙古传统乳酸发酵食品中筛选出具有抑酵母作用的乳杆菌,对其代谢产生的抑菌物质进行分离纯化。结果表明:ALAC-3和ALAC-4菌株的代谢产物粗提液通过Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化后,分别得到抑菌活性组分G100-3和G100-5,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测均达到电泳纯,相对分子质量分别为80.49 ku和40.32 ku。经过薄层色谱法证明G100-3和G100-5为单一成分的抑菌物质。

乳杆菌,抑酵母作用,活性物质,分离纯化

乳杆菌是一类革兰氏阳性菌、能够利用葡萄糖产生大量乳酸的细菌通称[1]。近几年,在食品中由病原菌和腐败菌引起的食品安全事故频繁的爆发[2]。经统计,世界上约有四分之一的粮食曾被酵母菌污染,每年因污染浪费的粮食达到了2%[3]。国家的粮食每年就会损失占粮食总产量的将近四分之一。

乳杆菌在代谢过程产生的细菌素对近源菌种或同种的菌种有特异性的抑制作用,但对酵母没有抑制作用[4]。近几年,随着科学的发展,研究表明抑制酵母菌的活性物质主要有几大类:有机酸、脂肪酸、环肽等,乳杆菌产生的抑菌物质的研究具有广阔的应用前景。乳杆菌产生的碳水化合物如乳酸和乙酸等可以作为发酵生产的最终产品[5]。苯乳酸现如今也引起了研究学者的重视,因其有良好的并且高效的抑真菌和细菌作用,而被作为抗真菌制剂来研究[6]。到目前为止,大量研究证明蛋白类的物质对酵母有一定的抑制作用[7-8]。

目前测定乳杆菌抑菌作用的有效技术很少,所以今后研究工作的重点是研究检测抑酵母菌化合物的方法[9]。菌株的代谢物质常用的分离纯化方法主要包括萃取法、硫酸铵盐析法、超滤法、凝胶层析法、高效液相色谱法等。凝胶过滤又叫分子筛层析,主要是依据蛋白质的大小和形状的不同进行分离和纯化[10]。

本研究旨在将乳杆菌代谢产物经凝胶过滤层析分离,并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定相对分子质量,且通过薄层色谱确定分离纯度,为进一步研究其结构并鉴定奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

乳杆菌从内蒙古传统发酵食品中筛选出的2株抑酵母活性较强的乳杆菌ALAC-3、ALAC-4。

指示菌白假丝酵母(Candidaalbicans)标准菌株,编号为32819,来自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

酵母提取粉,氯化钠,柠檬酸氢二胺,细菌学蛋白胨,磷酸氢二钾,大豆蛋白胨,硫酸锰,硫酸镁,牛肉浸膏,葡萄糖,琼脂粉,硫酸铵,TWEEN 80,胰蛋白胨,无水氯化钙,TEMED,Trizma 碱,无水甲醇,SDS,冰乙酸,Bromophenol blue均为分析纯。

表2　Bradford法标准曲线的绘制

SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台苏州博莱尔净化设备有限公司,BCD-249CF美菱冰箱合肥美菱股份有限公司,DPX-9162B-1电热恒温培养箱上海福玛实验设备有限公司,可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司,KDC-140HR高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司,HPX-9052 MBE数显电热培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂,L600低速自动平衡离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司,YC-1数控层析冷柜上海青浦沪西仪器厂,JC-TS-2脱色摇床济南精诚实验仪器有限公司,旋转蒸发仪广州仪科实验室技术有限公司,BG系列电泳装置北京百晶生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1主要溶液的配制

1.2.1.1蛋白类物质分离用溶液100%饱和硫酸铵:称取硫酸铵80 g,蒸馏水100 mL,在低于60 ℃温度下搅拌至溶解[11]。洗脱液:将超纯水超声波脱气后备用。

1.2.1.2Bradford法测定蛋白质含量溶液标准蛋白溶液的配制准确称取10 mg标准牛血清蛋白,用蒸馏水定容到10 mL。考马斯亮蓝G-250试剂:称取10 mg考马斯亮蓝G-250,溶于5 mL 95%乙醇中,加入85%磷酸10 mL,用蒸馏水定容到100 mL[12]。

1.2.1.3SDS-PAGE电泳用溶液配制1 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液、1.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液、50%甘油、10%过硫酸铵溶液、电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、上样缓冲液等[13]。按表1配制SDS-PAGE分离胶和浓缩胶。

表1　SDS-PAGE分离胶和浓缩胶配方

1.2.2乳杆菌抑菌粗提物的制备将穿刺保藏的乳杆菌接种到5 mL MRS液体培养基中活化一代,37 ℃培养16～24 h后发酵,将100 mL发酵液离心(3000 r/min,10 min),将上清液用旋转蒸发仪浓缩至25倍,加入饱和硫酸铵使粗提物的饱和度达到40%,摇匀,使硫酸铵充分沉淀蛋白类活性物质,然后放入冰箱,沉淀过夜。将加了饱和硫酸铵的粗提物冷冻离心(10000 r/min,20 min),将上清液倒掉,加少量脱气水溶解,并且用Bradford法测定蛋白含量,调至其浓度约为50 μg/mL,待层析柱上样备用[14]。

1.2.3Bradford法测定溶液中的蛋白含量以1 mg/mL牛血清蛋白溶液为标准溶液,绘制标准曲线。按表2所示一次在试管中加入相应试剂,漩涡震荡混匀,室温静置2 min,以0号管作为空白,于595 nm波长下测定光吸收值,以蛋白含量为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

用移液器吸取0.1 mL待测样品,加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂,震荡混匀,室温静置2 min,于595 nm波长下测定光吸收值,绘制标准曲线。结果如图1。

1.2.4凝胶过滤层析分离纯化蛋白葡聚糖凝胶过滤层析是利用凝胶的网状结构,使小分子物质能进入其内部,而大分子物质却被阻挡在外部,从而使混合溶液中各种组分按分子质量不同进行筛分。根据预实验的结果选用Sephadex G-100对饱和硫酸铵沉淀粗蛋白进行分离。把干燥的Sephadex G-100在洗脱液中浸泡,充分溶胀,轻轻搅拌,防止颗粒破碎。也可将其置于100 ℃度沸水中30 min,这样可以有效的除去凝胶中的气泡。将层析柱和其他的配件都清洗好后,把下口接好,并且从上口加入缓冲液,为把下面接口中的气泡除去,当层析柱中剩下2 cm液柱时,关闭下口。吸去部分溶胀好的凝胶上清液,用搅拌棒轻轻的搅拌凝胶凝胶,并且顺着搅拌棒缓缓倒入层析柱,待柱中沉降一定量凝胶后,打开下口,直至凝胶沉积至所需高度(过程中必须保证胶上方保留2 cm的洗脱液)。后加盖,并接上储液瓶,用恒流泵控制流速,开始滴注洗脱平衡液。洗脱大致两个柱床的洗脱液为止,为了使胶床稳定。并且检查柱子装的是否均匀,有无断层,有无气泡(若有需重装)。将下口关闭,停止洗脱,并且使柱床上的洗脱液自然流出直至刚刚露出胶面,停止洗脱,将饱和硫酸铵沉淀后的乳杆菌粗提物回溶于少量脱气超纯水中,使其蛋白含量达到50 μg/ml,将大约300 μL的此样品用吸管缓缓地沿着层析柱壁流入,而且不能搅动胶床。打开下口,使样品流入柱床后,关闭下口,停止洗脱液流动。再如上法,手动加入少量洗脱液,使胶面上方保持2 cm的洗脱液。打开下口,利用恒流泵控制流速为0.3 mL/min,用自动部分收集器收集流出的液体,每管1.2 mL,一共收集100管。每管取0.1 mL收集液作为待测样品,测定OD值,作出图谱,并且将出现峰值的试管收集起来,浓缩约60倍,采用牛津杯法测定抑菌活性[15]。

1.2.5SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白纯度和分子量采用12%的分离胶和5%的浓缩胶制作凝胶。将经过层析柱分离纯化后的乳杆菌收集液作为待测样品。将待测样品与上样缓冲液以1∶1的比例混合,并且在沸水浴中处理5 min。用微量移液器取20 μL已处理后的样品加入到样品口,且以10～200 ku蛋白质标准品作为Marker。连接电极,设定电压为100 mv,至样品前沿迁移至胶底部时结束电泳,用时大约3 h。当电泳结束后,将凝胶从电泳槽中取出,放到考马斯亮蓝染色液中,置于摇床上,过夜染色,弃去染液,用脱色液漂洗。分析电泳结果。电泳结束后需要先计算相对迁移率即Rf值,它是用测量的每个蛋白谱带的迁移距离与溴酚蓝前沿的迁移距离的比值。测量位置应在每个蛋白质电泳谱带的中央处。纵坐标是已知蛋白质的相对分子质量的常用对数值,横坐标是Rf,后作图。通过测定未知蛋白的Rf值,便可在标曲上读出相对分子质量。本实验对实验产物G100-3和G100-5作SDS聚丙烯酰胺电泳,进行染色、脱色[16]。

1.2.6抑菌成分薄层层析将硅胶板(GF254)在105 ℃下活化30～100 min,且冷却至室温。在薄层板下端1 cm出轻轻划一条基线,用微量注射器点1、2 μL,晾干,然后将点样后的薄层板放在展开剂中,展开剂是氯仿∶甲醇∶水为10∶5∶2的混合液。当展开剂达到了薄层板大约4/5处时,取出挥干[17]。

2　结果与分析

2.1Bradford法测定溶液中的蛋白含量

Bradford法标准曲线如图1。

图1　Bradford法标准曲线Fig.1　Bradford standard curve

该曲线线性回归方程为:Y=0.009x+0.003,R2=0.9986,Bradford法在标准牛血清蛋白浓度在0～100 μg/mL的范围内的线性关系良好。

2.2凝胶过滤层析分离纯化蛋白

按照1.2.4方法对饱和硫酸铵沉淀的粗蛋白进行分离。洗脱曲线如图2、图3所示。

图2　G-100凝胶过滤层析结果(ALAC-3)Fig.2　Results of G-100 gel filtration chromatography(ALAC-3)

对于ALAC-3代谢产物,洗脱过程出现三个蛋白峰,稳定性较好,第三个峰较前两个峰对称性好(图2)。三个峰顶点处蛋白含量分别为35.22、48.56、68.56 μg/mL。将29-38、45-54、59-79管分别收集起来,即为G100-1、G100-2、G100-3。浓缩后,进行抑菌实验,只有G100-3成分有抑菌圈,抑菌圈大小为14.27 mm。收集G100-3进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度及相对分子质量。

对于ALAC-4代谢产物,洗脱过程出现两个蛋白峰,两个峰稳定性和对称性都较好(图3)。两个峰顶点处蛋白含量分别为40.78、71.89 μg/mL。将41-52、61-77管分别收集起来,即为G100-4、G100-5。浓缩后,进行抑菌实验,只有G100-5成分有抑菌圈,抑菌圈大小为12.89 mm。收集G100-5进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度及相对分子质量。

图3　G-100凝胶过滤层析结果(ALAC-4) Fig.3　Results of G-100 gel filtration chromatography(ALAC-4)

2.3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

对收集得到的G100-3和G100-5按照方法1.2.5进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结果如图4、图5。

图4　G100-3的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.4　SDS polyacrylamide gel electrophoresis of G100-3

图5　G100-5的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.5　SDS polyacrylamide gel electrophoresis of G100-5

由图4可以看出,菌株ALAC-3的代谢产物的粗提液通过G-100凝胶过滤层析后,组分G100-3达到了电泳纯。组分迁移了约14.14 mm,上样缓冲液迁移了62 mm,根据标准蛋白的标准曲线y=-1.2734x+5.1961计算出组分G100-3的分子量约为80.49 ku。

由图5可以看出,菌株ALAC-4的代谢产物粗提液通过G-100凝胶过滤层析后,组分G100-5达到了电泳纯。组分迁移了约40.04 mm,上样缓冲液迁移了了77 mm,根据标准蛋白的标准曲线y=-1.083x+5.1687可以计算出组分G100-5的分子量约为40.32 ku。

2.4抑菌成分薄层层析

将具有抑菌效果的组分G100-3(蛋白含量为68.56 μg/mL)和G100-5(蛋白含量为71.89 μg/mL)按照实验方法1.2.6进行薄层层析。在硅胶板上都显示单一点。由此可见,利用葡聚糖凝胶电泳可以有效地将乳杆菌抑菌活性物质分离,得到G100-3和G100-5为单一成分的抑菌成分。

3　结论

本实验以白假丝酵母为指示菌,对具有抑酵母作用乳杆菌ALAC-3和ALAC-4产生的活性代谢产物进行分离纯化,得出以下结论:菌株ALAC-3和ALAC-4代谢活性物质经过Sephadex G-100凝胶过滤层析后分别得到具有抑酵母菌作用的组分G100-3和G100-5。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分别达到了电泳纯。G100-3的分子量约为80.49 ku,G100-5的分子量约为40.32 ku。且经过薄层色谱法证明G100-3和G100-5为单一成分的抑菌物质。

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Study on separation of antiyeast active substances produced byLactobacillus

CHEN Zhong-jun,GAO He-chen,LI Hai-xuan,ZHENG Zhong-wen,ZHAO Jie

(Inner Mongolia Agricultural University,College of Food Science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The characteristics of antiyeast substances produced by Lactobacillus,which were isolated from traditional dairy fermentation food in Inner Mongolia were studied. The results were showed as follows:The active substances of ALAC-3 and ALAC-4 were separated and purified by G-100 Sephadex gel filtration chromatography.And then the G100-3 and G100-5 were obtained respectively. They were analytically pure and the molecular weights were about 80.49 ku and 40.32 ku respectively through SDS-PAGE. G100-3 and G100-5 were judged separately as the single substances according to the thin-layer chromatography.

Lactobacillus;inhibiting yeast function;active substances;separation and purification

2016-01-08

陈忠军(1971-)，女，博士，教授，从事食品微生物及发酵工程的研究,E-mail:nmndchen@126.com。

国家自然基金(31260390)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)13-0188-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.029