美洲大蠊不同提取物清除自由基及抗脂质过氧化活性研究

唐霞光,张春妹,刘　嘉,肖培云,*,杨永寿

(1.大理大学药学与化学学院,云南大理 671000;2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南大理 671000)



美洲大蠊不同提取物清除自由基及抗脂质过氧化活性研究

唐霞光1,张春妹1,刘嘉1,肖培云1,*,杨永寿2

(1.大理大学药学与化学学院,云南大理 671000;2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南大理 671000)

目的:研究美洲大蠊不同提取物ML-A,ML-A1,ML-A2,ML-A3,ML-A4,ML-A5,ML-A6,ML-A7清除自由基及抗脂质过氧化活性的作用。方法:采用DPPH法研究美洲大蠊不同提取物清除自由基的能力,用硫代巴比妥酸(TBARS)法研究美洲大蠊提取物对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的抑制作用,评价其抗脂质过氧化能力。结果:美洲大蠊不同提取物对DPPH自由基均有一定的清除作用,能抑制肝组织匀浆自发性脂质氧化产物MDA的产生。结论:ML-A2对DPPH自由基的清除作用最强,ML-A4对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用最强。

美洲大蠊提取物,氧自由基,脂质过氧化,抗氧化

美洲大蠊,作为一种传统中药材,因其对多种疾病的治疗作用而逐渐引起人们的关注。然而,美洲大蠊的食用价值至今开发较少,加之人们一直视蟑螂为害虫,对食用昆虫药了解甚微,导致美洲大蠊多以可食用干燥虫品及精粉在市场流通。近几十年的研究发现蟑螂含有大量的蛋白质、氨基酸、矿质元素和微量元素,具有很高的药用、食用价值。随着人们生活水平的提高,人们对健康问题的关注更加密切,具有预防疾病及延缓衰老功能的保健品逐渐成为人们的首选。

自由基主要包括各种形式的活性氧,性质活泼,氧化作用极强[1],能直接与细胞膜上的成分发生反应,引起细胞膜脂质过氧化,使相应蛋白质和酶的活性发生改变,损伤线粒体,攻击DNA,诱导基因突变[2],对人体产生很大的伤害。临床上常见的免疫性损伤和炎性损伤等与氧自由基及其引起的脂质过氧化反应密切相关。药用昆虫美洲大蠊(Periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫,俗称“蟑螂”,其入药始载于《神农本草经》[3],研究表明,美洲大蠊不同提取物具有抗肿瘤、抗病毒、促进组织修复等作用[4-6]。近年来随着对美洲大蠊化学成分及药理作用的深入研究,其药用价值也受到广泛的关注,以美洲大蠊为原料的抗乙肝病毒新药“肝龙胶囊”及正在研发的抗衰老活性部位均有一定的体外抗氧化作用[7-8]。

DPPH法来评价外源抗氧化剂和植物抗氧化能力是一种快速、简便、灵敏、直接可行的方法,抗氧化剂直接作用于DPPH自由基,与间接测定氧化产物的减少的方法相比,该法通过测定DPPH自由基吸收的变化即可评价药物的抗氧化能力[9]。体内抗氧化能力评价主要是借助氧化应激生物标志物的测定来判断生物活性物质,其中对脂质过氧化的保护程度是常用评价方法之一,硫代巴比妥酸(TBARS)法就是一种被广泛使用、非侵入性的体内评价脂质过氧化方法[10]。本研究从美洲大蠊中经过分离纯化得到不同的提取部位,采用 DPPH与TBARS法相结合,系统研究不同提取部位清除氧自由基和抗脂质过氧化的作用效果,旨在为下一步的药理活性研究和美洲大蠊资源的进一步开发利用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

美洲大蠊不同溶剂提取物冻干粉;1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)东京化成工业株式会社;硫代巴比妥酸国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、三氯乙酸、维生素C均为分析纯;水超纯水;SD昆明大鼠,180～220 g,雄性,大理大学实验动物中心提供。

UV2500型紫外分光光度计日本岛津公司;GeneQuant 100型微量紫外分光光度计美国Ge公司;LC-4012型低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1美洲大蠊不同提取物对DPPH的清除作用DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基,其无水乙醇溶液在517 nm处有最大吸收[11]。DPPH自由基与美洲大蠊不同提取物溶液反应后,DPPH自由基的量会减少,在517 nm处的吸光度值会降低,通过计算反应后DPPH自由基的清除率评价抗氧化剂的抗氧化能力[12]。参考文献方法略作修改[7-8],实验分为空白管、对照管、药物底管及药物管,药物底管和药物管中分别精密加入美洲大蠊不同提取物溶液1 mL,空白管及药物底管中精密加入2.0 mL无水乙醇,对照管及药物管中精密加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基溶液(均在10 mL棕色量瓶中操作),密封,混匀,暗处放置30 min,用超纯水定容至刻度,摇匀,于517 nm处测定吸光值,按下式计算自由基的清除率:

DPPH清除率:I(%)=[A对-(A药物管-A药物底管)]/A对×100

其中:A对为对照管的吸光度,A药物管为加入药物溶液的吸光度,A药物底管为不加DPPH药物溶液本底的吸光度。

1.2.2美洲大蠊提取物大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用将健康大鼠禁食12 h,麻醉后迅速取肝脏,剪去脂肪及筋膜组织,用预冷的生理盐水洗净,滤纸拭干,称重后,剪碎。以生理盐水为匀浆介质,肝脏与生理盐水重量比为1∶9,用玻璃匀浆器在冰水浴中研磨制得10%大鼠肝匀浆,低温离心(3000 r/min,10 min),取上清液于冰箱中冷冻备用。参照文献方法略作修改[13],实验分空白管、对照管、药物底管和药物管。取10%肝组织匀浆上清液0.5 mL分别加入对照管和药物管,空白管和药物底管加0.5 mL生理盐水。药物管和药物底管加入不同浓度的美洲大蠊提取物0.5 mL,空白管和对照管加入蒸馏水0.5 mL,摇匀,37 ℃恒温水浴振荡1 h,各管加入10%硫代巴比妥酸溶液(精密称取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中,先用1 mol/L NaOH溶液溶解,再用10%三氯乙酸定容至刻度),80 ℃水浴15 min,冷却,离心(3000 r/min,10 min),以空白管标零,取上清液于532 nm处测定吸光度,平行操作三次,按下式计算抑制率:

抑制率:I(%)=[A对-(A药物管-A药物底管)]/A对×100

其中:A对为对照管的吸光度,A药物管为加入药物溶液的吸光度,A药物底管为不加大鼠肝组织匀浆药物溶液本底的吸光度。

2　结果与分析

2.1维生素C对DPPH·的清除作用

维生素C具有很强的抗氧化活性,在天然产物抗氧化活性研究中维生素C常被用来作为评价抗氧化能力强弱的参照[14]。用1.2.1项下方法测定维生素C对DPPH自由基的清除曲线,其结果如图1,根据计算,IC50值为0.0106 mg/mL。

图1　维生素C对DPPH自由基的清除曲线Fig.1　The clearance curve of VC on DPPH free radical

2.2美洲大蠊不同提取物对DPPH自由基的清除作用

如图2为美洲大蠊不同提取物对DPPH自由基的清除曲线,由图可知,美洲大蠊不同提取物对DPPH自由基均有一定的清除作用,但强弱有所不同。随着提取物浓度的升高,清除DPPH自由基的能力也增强。与其他提取物相比,ML-A与ML-A2对DPPH自由基的清除作用较强,药物浓度为1.0 mg/mL时清除率可以达到80%以上。根据计算,各提取物清除DPPH的IC50值分别为:ML-A,0.336 mg/mL;ML-A1,0.966 mg/mL;ML-A2,0.311 mg/mL;ML-A3,0.436 mg/mL;ML-A4,0.474 mg/mL;ML-A5,0.652 mg/mL;ML-A6,27.55 mg/mL;ML-A7,5.32 mg/mL。以IC50值评价,可知ML-A2对DPPH的清除作用最强。

图2　美洲大蠊不同提取物对DPPH自由基的清除曲线Fig.2　The clearance curve of Periplaneta Americanadifferent extract on DPPH free radical

2.3维生素C对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用

丙二醛(MDA)作为一种脂质过氧化终产物,是反映细胞氧化损伤程度的一个重要指标。用硫代巴比妥酸(TBA)法考察抗氧化剂对MDA的抑制作用,以此评价抗氧化剂抗脂质过氧化活性[13]。用1.2.2项下方法评价维生素C对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化产物MDA的抑制作用,结果如表1。三个质量浓度的维生素C均可抑制肝组织匀浆自发性脂质过氧化,其中当VC反应浓度为1.5 mg/mL时,对MDA的抑制作用可以达到70%以上。

表1维生素C对肝组织匀浆自发性

Table 1The inhibition of VCon MDA

样品质量浓度(mg/mL)抑制率(%)维生素C0.543.20±1.211.060.68±1.941.570.39±1.75

2.4美洲大蠊不同提取物对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用

测定5.0、10.0、15.0 mg/mL三个剂量点时美洲大蠊不同提取物对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用,结果如表2。随着药物浓度增加,各提取物对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化抑制作用也逐渐增强。当药物浓度为5.0 mg/mL时,各提取物的抑制作用差异较大。其中,ML-A4抑制率最高(49.35%±1.50%),抑制作用最强;ML-A6抑制率最低(4.69%±0.73%),抑制作用最弱。当药物浓度为10.0 mg/mL时,除ML-A6(39.32%±5.34%)与ML-A7(44.98%±2.28%)两者抑制作用较弱外,其它提取物抑制作用相当。当药物浓度为10.0 mg/mL时,ML-A与ML-A4抑制作用最强,抑制率分别为72.65%±2.91%、72.33%±1.94%。综上可知,ML-A4对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用最强,抗脂质过氧化活性最高。

样品质量浓度(mg/mL)抑制率(%)ML-A5.036.25±1.5510.051.29±4.5015.072.65±2.91ML-A15.037.06±2.7710.049.84±4.3715.066.34±2.96ML-A25.029.61±2.4310.049.84±4.3715.065.53±2.72ML-A35.026.54±1.0210.048.22±2.7215.062.62±3.01ML-A45.049.35±1.5010.060.84±2.9115.072.33±1.94ML-A55.032.20±3.6910.049.68±2.4315.066.02±0.97ML-A65.04.69±0.7310.039.32±5.3415.054.53±2.43ML-A75.08.74±3.2010.044.98±2.2815.058.58±2.96

综上,美洲大蠊不同提取物、维生素C均有清除DPPH自由基和抗脂质过氧化作用,随着质量浓度的增加作用增强。美洲大蠊提取物表现出较强的抗氧化活性,但活性弱于维生素C。通过DPPH、TBA法这两种方法检测美洲大蠊不同提取物的抗氧化活性,发现ML-A2对DPPH自由基的清除作用最强,IC50值为0.311 mg/mL;ML-A4对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化的抑制作用最强,抑制率在70%以上。两种方法测定结果有一定差异,原因可能是不同提取部位中组成成分及含量不同,适用方法不一样。

3　讨论

本实验发现美洲大蠊不同提取物均有清除自由基及抗脂质过氧化的作用,其中ML-A2为清除DPPH自由基活性最强的部位,ML-A4为抗脂质过氧化活性最强的部位。研究结果说明美洲大蠊在保健品开发方面具有很高的潜力,本实验针对美洲大蠊不同提取物抗氧化能力进行评价,其抗氧化活性与治疗疾病之间的相关性有待进一步研究。

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Research of the effect ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts on scavenging free radical and anti-lipid perxidation

TANG Xia-guang1,ZHANG Chun-mei1,LIU Jia1,XIAO Pei-yun1,*,YANG Yong-shou2

(1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali 671000,China;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali 671000,China)

Objective:To study the effect of scavenging free radical and anti-lipid perxidation onPeriplanetaAmericanadifferent extract(ML-A,ML-A1,ML-A2,ML-A3,ML-A4,ML-A5,ML-A6,ML-A7). Method:DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts. Using TBA to study the inhibition ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts on MDA in the rat liver tissue homogenate. Result:PeriplanetaAmericanadifferent extracts had certain scavenging effect on DPPH· and could inhibit MDA the rat liver tissue lipid oxidation products of spontaneous generation. Conclusion:During the different extracts ofPeriplanetaAmericana,ML-A2 had the strongest effect of scavenging DPPH·,ML-A4 had the strongest effect of anti-lipid perxidation.

PeriplanetaAmericanaextracts;Oxygen free radical;lipid perxidation;antioxidant

2015-11-16

唐霞光(1991-),女,硕士研究生,主要从事美洲大蠊抗肺纤维化研究,E-mail:874808019@qq.com。

肖培云(1970-),女,硕士,教授,主要从事昆虫药物研究开发,E-mail:xpy990120@126.com。

国家自然科学基金(81360634,81560634);云南省科技厅应用基础研究重点项目(2015FA025)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0083-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.008