黑果枸杞多酚体外抗氧化活性研究

闫亚美,米　佳,禄　璐,冉林武,罗　青,李越鲲,李晓莺,曾晓雄，曹有龙,*

(1.国家枸杞工程技术研究中心,宁夏银川 750002;2.南京农业大学 食品科技学院,江苏南京 210095;3.宁夏医科大学实验动物中心,宁夏银川 750004)



黑果枸杞多酚体外抗氧化活性研究

闫亚美1,2,米佳1,禄璐1,冉林武3,*,罗青1,李越鲲1,李晓莺1,曾晓雄2，曹有龙1,*

(1.国家枸杞工程技术研究中心,宁夏银川 750002;2.南京农业大学 食品科技学院,江苏南京 210095;3.宁夏医科大学实验动物中心,宁夏银川 750004)

采用FRAP值、·OH清除力、DPPH自由基清除力、还原力和总抗氧化能力(TEAC)5个体外抗氧化指标对26个不同产地的黑果枸杞多酚进行抗氧化活性评价。结果表明,产地间样本抗氧化活性差异较大;抗氧化模型不同,其抗氧化活性存在差异;综合分析,样本来自宁夏回族自治区贺兰县12-01、宁夏回族自治区银川市掌政、青海省格尔木市乌图美仁乡、新疆维吾尔自治区阜康市甘河子镇、新疆维吾尔自治区喀什市、甘肃省民勤县中渠可作为较好的开发功能性食品的资源。

黑果枸杞,产地,多酚,抗氧化活性

氧化应激是许多慢性退行性疾病发生发展的主要机制,包括神经退行性病变、肿瘤、炎症性疾病等。探寻和研究具有抗氧化活性的天然植物化学物质用于抵抗人体的氧化应激,进而防治阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等与氧化应激相关的人类重大疾病,已成为医药、植物化学等多个学术领域共同关注的课题[1-3]。

花色苷是含多个酚羟基的黄酮类化合物。流行病学调查发现,长期摄入富含花色苷的食物,可明显降低动脉粥样硬化(AS)等心血管疾病的发病率,揭示花色苷可能具有潜在的抗AS作用,且抗氧化活性是其作用机制之一[4-6]。

体外抗氧化评价方法较之体内方法因其快速、便捷而应用广泛。利用性质稳定的自由基产生剂,通过对其的抑制或清除来衡量抗氧化物质抗氧化活性的高低是评价抗氧化活性的主要的体外方法,如FRAP值、·OH清除力、DPPH自由基清除力、还原力和TEAC等。然而由于每一种方法都有其适用范围和特点,并且,同一种抗氧化物质在不同的溶剂中溶解,或以不同的自由基为底物,都会使在相同的方法和测定条件下出来的结果有所差别[7]。因此,要全面科学地评价抗氧化物质的抗氧化活性,往往还是需要至少两种方法同时测定,以验证其活性的高低。故本文在预实验的基础上,根据黑果枸杞多酚及其溶剂的特性,筛选了FRAP值、·OH清除力、DPPH自由基清除力、还原力和TEAC等5种仪器成本低、易重复、作用机理差异较大的方法进行黑果枸杞多酚抗氧化活性的测定分析。

黑果枸杞富含花色苷等多酚[8-12],并具有较好的抗氧化活性等功效作用[8,11],且不同产地的黑果枸杞,其花色苷等多酚差异很大[7]。本文对不同产地的黑果枸杞多酚体外抗氧化活性进行分析研究,以期为黑果枸杞优质品种的选育、栽培、质量评价等积累科学数据和资料。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

表1　不同采样点地理因子表

如表1所示,在国内黑果枸杞分布面积较大的省(区)新疆、青海、宁夏、甘肃等地成熟果实,用GPS测定各实验点的海拔、纬度。各产地均采集混合样,并在盛果初期采集。果实采后用冰袋冷藏手工带柄采摘后冷冻干燥,0～4 ℃保藏。

ABTS,氮蓝四唑(NBT),1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),吩嗪硫酸甲酯(PMS),乙二胺四乙酸(EDTA),抗坏血酸(VC)等标准品Sigma(Sigma公司,St. Louis,MO,USA),其它试剂均为分析纯国药集团化学试剂有限公司。

RE-5286旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;UV755B紫外可见光分光光度计上海精密科学仪器有限公司;HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂;800B台式离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1黑果枸杞多酚提取黑果枸杞多酚提取,取200 g黑果枸杞粉碎,精确称取其中0.6000 g,加500 mL 0.5% TFA甲醇溶液,匀浆,4 ℃下避光浸渍提取24 h,4 000 r/min离心10 min,过滤,取上清液,低于40 ℃减压浓缩,浓缩液用0.5% TFA溶液定容至200 mL,过0.22 μm膜,-20℃保存隔天测定。

1.2.2抗氧化活性研究

1.2.2.1DPPH自由基清除能力测定参考闫亚美等[9]测定方法,各样品清除DPPH自由基能力表示为VC当量(mg/g),即每克样品抗氧化能力相当于VCmg数。

1.2.2.2还原力测定参照Oyaizu等[10]略作改动,取1 mL待测液,依次加入pH6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL,混合后在50 ℃放置20 min,然后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,4800 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL蒸馏水和0.1%氯化铁2.5 mL,混匀,静置10 min,在700 nm处测定吸光度。还原力的EC50值为还原力达到0.5时的样品浓度。各样品还原力表示为VC当量(mg/g),即每克样品还原能力相当于VCmg数。

1.2.2.3FRAP值测定参考闫亚美等[9]测定方法,以VC溶液作标准曲线(Y=0.0623X+0.0769,R2=0.9923),抗氧化能力表示为VC当量(mg/g),即每克样品抗氧化能力相当于VCmg数。

表2　26个不同来源黑果枸杞体外抗氧化活性研究

注:在同一列里,平均值带有不同上标字母的表示差异显著(p<0.05)。

1.2.2.4总抗氧化能力的测定(TEAC)参考闫亚美等[9]测定方法,样品清除能力表示为VC当量(mg/g),即每克样品总抗氧化能力相当于VCmg数。

1.2.2.5羟自由基(·OH)清除能力的测定根据Nicholas Smirnoff等方法[14]略作改动,于5 mL试管中,依次加入1 mL 8.8 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9.1 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、1 mL样品溶液、0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2,定容至4 mL。对照液中以1 mL蒸馏水替换同体积的水解液,37 ℃条件下保温0.5 h。以蒸馏水为参比液,在526 nm测定其吸光值。以VC溶液对羟自由基(·OH)清除能力作标准曲线(Y=0.1035X+0.1495,R2=0.9951),样品清除能力表示为VC当量(mg/g),即每克样品抗氧化能力相当于VCmg数。

计算清除羟基自由基的能力:

式中:A0-空白对照液的吸光值;Ax-加入样品溶液后的吸光值;Ax0-样品溶液本底吸光值。

1.3统计分析

使用SPSS软件(version 19.0)进行平均值方差分析(one-way ANOVA)和样本间的聚类分析。采用SIMCA-P11.5软件进行PLSR分析。

2　结果与分析

表2为26个不同产地黑果枸杞的5种不同体外的抗氧化活性的功效数据。方差分析表明,不同产地之间相同质量的黑果枸杞,其多酚抗氧化活性差异较大。以5个不同抗氧化活性指标为聚类参数,以变量即抗氧化活性指标进行分群,如图1所示,5个抗氧化活性聚为2类,一类为FRAP值、·OH清除力、还原力和总抗氧化能力,DPPH自由基清除力单独聚为一类。结合表2发现,不同产地之间FRAP值、·OH清除力、还原力和TEAC差异较大,而DPPH自由基清除力差异较小。这种差异性可能是由于不同抗氧化活性的作用机理不同而致,因此也验证了不能简单的用一种方法评价样本之间活性的大小。

以产地样本进行分群,选择5个抗氧化指标为聚类参数(变量)进行分析,与选择剔除DPPH自由基清除力聚类结果相同,如图2所示,共聚为5类,结合表2分析如下：其中，1号、2号、4号、6号、7号、8号、9号、10号、12号、15号、16号、26号聚为第一类，抗氧化活性最低，从抗氧化作用来讲，品质相对差一些。5号、21号、18号、13号聚为第二类，该类各产地样本整体上各自由基清除能力较弱，13号FRAP值、还原力及TEAC高于此类平均水平，21号DPPH低于此类平均水平；14号、19号、20号、23号聚为第三类，该类产地样品对各自由基清除力和还原力的能力较高，从抗氧化作用来讲，活性较高，其中19号、23号产地样本FRAP值低于此类平均水平，19号还原力低于此类平均水平，23号地区TEAC低于此类平均水平，14号贺兰12-1除·OH清除能力外，其它活性均显著高于此类水平；11号、17号、22号、24号、25号聚为第四类，对各自由基清除力和还原力的能力比上述三类高，该类产地样品从抗氧化作用来讲，品质也更高一些，分别来自宁夏银川市掌政、青海格尔木市乌图美仁乡、新疆阜康市甘河子镇、新疆喀什市、新疆混样；3号为来自甘肃民勤中渠,单独聚为第五类,自由基清除能力强、还原能力强,即表明具有良好的抗氧化活性,从抗氧化活性来讲,也是最好的样品。四个省区中也各有活性较好的样本,活性较差的样本。

图1　黑果枸杞抗氧化活性聚类分析树状图 Fig. 1　Dendrogram of HCA by in vitroantioxidant activity of L. ruthenicum Murr注：1.FRAP值;2.DPPH自由基清除能力;3.TEAC;4.还原力;5.·OH清除能力。

图2　不同产地黑果枸杞抗氧化活性聚类分析树状图 Fig.2　Dendrogram of HCA by in vitro antioxidant activity of L. ruthenicum Murr. from different places

3　结论

比较26个不同产地黑果枸杞多酚抗氧化活性,产地间抗氧化活性差异较大。抗氧化模型不同,其抗氧化活性存在差异。银川市掌政、青海格尔木市乌图美仁乡、新疆阜康市甘河子镇、新疆喀什市、甘肃民勤中渠、宁夏贺兰12-01、等产地的抗氧化活性较高。四个省区中也各有活性较好的产地,活性较差的产地。 该比较研究为黑果枸杞优质品种的选育、栽培、质量评价等积累科学数据和资料。

[1]Rao AV,Snyder DM. Raspberries and human health:A review[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(7):3871-3883.

[2]Kusznierewicz B,Piekarska A,Mrugalska B,et al. Phenolic composition and antioxidant properties of polish blue-berried honeysuckle genotypes by HPLC-DAD-MS,HPLC postcolumn derivatization with ABTS or FC,and TLC with DPPH visualization[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(7):1755-1763.

[3]Lakshmi SV,Padmaja G,Kuppusamy P,et al. Oxidative stress in cardiovascular disease[J]. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics. Biophys,2009,46(6):421-440.

[4]Ziberna L,Tramer F,Moze S,et al. Transport and bioactivity of cyanidin 3-glucoside into the vascular endothelium[J]. Free Radical Biology & Medicine,2012,52(9):1750-1759.

[5]Ziberna L,Kim J,Auger C,et al. Role of endothelial cell membrane transport in red wine polyphenols-induced coronary vasorelaxation:involvement of bilitranslocase[J]. Food Function,2013,4(10):1452.

[6]Youdim KA,Martin A,Joseph JA. Incorporation of the elderberry anthocyanins by endothelial cells increases protection against oxidative stress[J]. Free Radical Biology and Medicine,2000,29(1):51-60.

[7]周昇昇. 我国常见保健食品原料抗氧化活性的研究[D]. 北京:中国疾病预防控制中心,2010:68-92.

[8]闫亚美,戴国礼,冉林武,等.不同产地野生黑果枸杞资源果实多酚组成分析[J].中国农业科学,2014,422(12):4540-4550.

[9]闫亚美,冉林武,曹有龙,等. 黑果枸杞与5种果蔬中花色苷组成及体外抗氧化活性比较[J].食品工业科技,2014,25:1245-1248.

[10]闫亚美,罗青,冉林武,等. 黑果枸杞产业发展前景[J].宁夏农林科技,2015,56(01):21-23,57.

[11]闫亚美,张晓敏,冉林武,等. HPLC半定量法测定黑果枸杞花色苷含量[J].食品工业,2014,35(16):133-136

[12]李进. 黑果枸杞色素研究[D]. 上海:华东师范大学:2006:1-3.

[13]Oyaizu,M. Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine[J]. Japan. Nutrition. Science., 1986,44(6):307-315.

[14]Nicholas S,Quinton C. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry,1989,28(4):1057-1060.

Antioxidant activity of polyphenols fromLyciumruthenicumMurr.

YAN Ya-mei1,2,MI Jia1,LU Lu1,RAN Lin-wu3,*,LUO Qing1,LI Yue-kun1,LI Xiao-ying1,ZENG Xiao-xiong2,CAO You-long1,*

(1.National Wolfberry Engineering Research Center,Yinchuan 750002,China;2.College of Food Science and Technology,Nanjing Agriculture University,Nanjing 210095,China;3.Laboratory Animals Center,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Five different assays,including FRAP values,hydroxyl radical scavenging capacities,DPPH radical scavenging capacities,reduce power and ABTS radical scavenging capacities were used to study the antioxidant activity of the polyphenols ofLyciumruthenicumMurr. from 26 different places. The results indicated thatinvitroantioxidant activity of polyphenols fromLyciumruthenicumMurr. from different places were different,and the results of the same sample were different from 12-01 Helan Ningxia,Zhangzhen Town Yinchuan City Ningxia Hui Autonomous Region,Wutumeiren Town Geermu City Qinghai Province,Ganhezi Town Fukang City Xinjiang Uighur Autonomous region,Kashi City Xinjiang Uighur Autonomous region,Zhongqu Town Mingqin County Gansu province had better antioxidant activities and can be used to be good resource for development of healthy food.

LyciumruthenicumMurr.;place of production;polyphenols;antioxidant activity

2015-10-16

闫亚美(1982-),女,博士,副研究员,研究方向：枸杞加工与贮藏,E-mail:yanyamei@163.com。

冉林武(1979-),男,博士,副教授,从事人类营养与疾病研究,E-mail:ranlinwu@163.com。

曹有龙(1963-)，男,博士,研究员,从事枸杞植物学研究,E-mail:youlongck@163.com。

国家自然基金(31360076);宁夏自然科学基金(NZ15124);宁夏农林科学院先导项目(NKYJ-15-16、NKYJ-14-26)项目资助。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0049-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.001