辛伐他汀对不稳定斑块模型家兔血栓形成的影响*

杨 琳，卢 斌，杜 云，郭茂娟，张云莎，李虎虎，曾文赟，马东明，姜希娟

（1.天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193；2.天津高等医学专科学校医疗系，天津 300222）

·实验研究·

辛伐他汀对不稳定斑块模型家兔血栓形成的影响*

杨 琳1，卢 斌1，杜 云2，郭茂娟1，张云莎1，李虎虎1，曾文赟1，马东明1，姜希娟1

（1.天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193；2.天津高等医学专科学校医疗系，天津 300222）

［目的］探讨辛伐他汀对动脉粥样硬化（AS）不稳定斑块家兔模型血栓形成的影响。［方法］将雄性新西兰家兔随机分两组，其中一组（假手术组）始终给予正常饮食，另一组给予高脂饲料喂养4周后，行腹主动脉球囊拉伤术，术后继续4周高脂饮食后转为正常饮食，并随机分为模型组和辛伐他汀组，辛伐他汀组给予辛伐他汀［10 mg/（kg·d）］灌胃4周，假手术组和模型组则给予等体积的生理盐水灌胃。各组家兔于药物干预4周后处死，处死前48 h和24 h两次行腹膜下注射蛇毒（0.15 mg/kg）和耳缘静脉注射组胺（0.02 mg/kg）药物触发斑块破裂。处死后取腹主动脉于体视镜下观察血栓形成情况，采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）和D-二聚体，放免法检测血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的浓度，并计算TXB2/6-keto-PGF1α的比值。［结果］辛伐他汀干预4周后，体视显微镜下观察斑块部位血栓形成减少，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），血浆vWF：Ag和D-二聚体水平均降低，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01），血浆TXB2浓度降低、6-keto-PGF1α浓度升高，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），TXB2/6-keto-PGF1α降低，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。［结论］辛伐他汀能够修复受损血管内皮细胞，改善血液高凝状态，抑制血小板聚集等，进而发挥抗血栓形成的作用，为辛伐他汀临床针对AS不稳定斑块患者，预防其血栓形成提供了实验依据。

辛伐他汀；动脉粥样硬化；不稳定斑块；血栓形成

随着人们物质生活水平的提高，动脉粥样硬化（AS）的发病率逐年升高。复杂的AS斑块往往结构不稳定，易发生破裂或糜烂，后者因动脉内皮缺失启动凝血系统促进血栓形成，导致心肌梗死等急性心血管事件发生，乃至危及生命。世界卫生组织（WHO）报道［1］AS所致的急性心血管事件2012年病死人数为740万，占总病死人数的13.2%，病死率较2000年上升23.3%，成为全球首位死因。

高胆固醇血症是AS发生的物质基础。因此，降低血浆胆固醇水平是抗AS重要治疗手段。3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶是胆固醇合成的限速酶，直接影响胆固醇的合成速率和血浆胆固醇的水平。目前，辛伐他汀作为HMG-CoA的抑制剂，被临床广泛用于降低血浆胆固醇，防治AS。但近年来发现辛伐他汀作用机制复杂，除降低胆固醇外，可通过抗炎、抗凋亡等抑制AS的发生发展［2］。AS斑块破裂或糜烂继发血栓形成是AS的常见并发症和致死原因。辛伐他汀抗AS所致血栓形成疗效和机制尚待进一步证实。因此，本实验复制AS不稳定斑块家兔模型，观察辛伐他汀对该模型血栓形成的影响，为拓展辛伐他汀的临床应用范围提供实验支持。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 26只SPF级雄性新西兰家兔，体质量2.4～2.9 kg（购自北京龙安实验动物繁育中心）。

1.1.2 实验试剂和仪器 辛伐他汀片（舒降之，杭州默沙东制药有限公司），高脂饲料（1%胆固醇+5%猪油+5%蛋黄粉+89%基础饲料，其中胆固醇购自天津市大茂化学试剂厂），鲁塞尔蝰蛇毒（RVV，Sigma Chemical Co，美国），组胺（Sigma Chemical Co，美国），血管性血友病因子抗原（vWF：Ag，上海索莱宝生物技术有限公司），D-二聚体（D-Dimer，上海易生物技术研究所），血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α （6-keto-PGF1α）放免试剂盒（解放军总医院科技开发公司），球囊导管及附件（Cordis公司，美国），微机多探头γ计数仪（FT-630G型，北京），体视显微镜（Olympus，SZXY7，日本），多功能微孔读板机（Endpine，美国Perkin Elmer公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验模型的制备 将26只家兔称重后，按体质量从轻到重依次1～26号排列，依照安全随机法，利用Excel文件中的“随机数发生器”进行随机分组，其中，一组作为假手术组（n=8），始终给予正常饮食，其余18只家兔给予高脂饲料饲养4周，行腹主动脉球囊拉伤术。模型制作过程简述如下：3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉麻醉，同时静脉给予肝素（200 U/kg，以防止插管过程中发生凝血），切开右股动脉，结扎远心端。沿0.014的导丝从股动脉切口逆行插入球囊（内径3.5 mm，长15 mm）约20 cm，回抽3 cm，连接手推式压力泵，注入肝素生理盐水，膨至8个大气压，向着髂总动脉轻柔回拉，重复3次，行腹主动脉壁气囊拉伤术。假手术组：家兔仅行腹主动脉切口，并不进行球囊拉伤。术后常规注射抗生素3 d以预防感染。

1.2.2 给药剂量和给药方法 模型制作过程中，因麻醉意外和失血过多死亡2只。模型制作成功的16只家兔继续给予4周高脂饮食后转为正常饮食，并按上述随机分组法再次随机分为模型组（n=8）和辛伐他汀组（n=8）。辛伐他汀组给予10 mg/（kg·d）的辛伐他汀混悬液灌胃干预4周，相同干预时间内假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃。

1.2.3 药物触发 药物干预结束后，参照Constantinides等［3］方法将所有家兔行药物触发：腹膜下注射蛇毒（RVV，0.15 mg/kg），30 min后，经耳缘静脉注射组胺（0.02 mg/kg），于处死动物前24 h和48 h分别给予2次触发。

1.3 指标检测

1.3.1 标本采集和血栓的体视显微镜观察 于处死动物前，禁食12 h，不禁水。经耳缘静脉取血，2% EDTA Na2抗凝，离心（3 000 r/min）30 min获得血浆；取腹主动脉，生理盐水冲洗后，纵行剖开腹主动脉，平铺于滤纸上，体视显微镜下观察可视血栓形成情况。

1.3.2 酶联免疫吸附测定（ELISA）法 取各组家兔血浆，采用ELISA法测定血浆中vWF：Ag和D-二聚体，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.3 放射免疫分析法 以125I-TXB2和125I-6-keto-PGF1α为示踪标记物，采用放射免疫分析法测定血浆TXB2和6-keto-PGF1α的浓度，严格按照试剂盒说明书操作，并计算TXB2/6-keto-PGF1α的比值。

1.4 统计分析 采用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料实验数据以均数±标准差（±s）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett'T3法，组间率的比较采用卡方检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉斑块血栓形成情况 球囊拉伤后合并高脂饮食8周后，变换为正常饮食并给予药物干预4周后，以蝰蛇毒和组胺诱导斑块破裂和血栓形成。体视显微镜下，可见假手术组无斑块和血栓形成（0%），模型组和辛伐他汀组斑块血栓受损继发血栓形成率分别为6/8（75%）和2/8（25%），见表1。模型组与假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；辛伐他汀组与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 不同组别斑块受损激发血栓形成的比较

2.2 辛伐他汀对血浆vWF：Ag和D-二聚体的影响 结果显示，模型组动物高胆固醇饮食合并球囊损伤，可提高血浆vWF：Ag和D-二聚体水平，与假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。辛伐他汀干预4周后，血浆vWF：Ag和D-二聚体水平均降低，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01），提示辛伐他汀对血浆vWF：Ag和D-二聚体有明显的抑制作用，见表2。

表2 不同组别血浆vWF:Ag和D-二聚体浓度的比较（±s）

表2 不同组别血浆vWF:Ag和D-二聚体浓度的比较（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

组别 n vWF：Ag（%） D-二聚体（mg/L）假手术组 8 120.121±23.298** 0.266±0.061**模型组 8 168.954±23.586 1.640±0.392辛伐他汀组 8 132.993±23.160** 1.056±0.376**

2.3 辛伐他汀对血浆TXB2和6-keto-PGF1α浓度及TXB2/6-keto-PGF1α的影响 结果显示，模型组动物高胆固醇饮食合并球囊损伤后，血浆TXB2浓度升高、6-keto-PGF1α浓度降低、TXB2/6-keto-PGF1α升高，与假手术组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。辛伐他汀干预4周后，血浆TXB2浓度、TXB2/6-keto-PGF1α降低、而6-keto-PGF1α浓度升高，其中，TXB2和6-keto-PGF1α与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；TXB2/6-keto-PGF1α与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01），提示辛伐他汀可降低血浆TXB2浓度、升高6-keto-PGF1α浓度，进而降低TXB2/6-keto-PGF1α，见表3。

表3 不同组别血浆TXB2和6-keto-PGF1α浓度及TXB2/6-keto-PGF1α的比较（±s）

表3 不同组别血浆TXB2和6-keto-PGF1α浓度及TXB2/6-keto-PGF1α的比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 n TXB2 （ng/L）6-keto-PGF1α （ng/L）

3 讨论

动脉粥样硬化发生临床急性事件最基本的深层原因，是复杂动脉粥样斑块易损，在此基础上斑块破裂或者糜烂合并血栓形成。高胆固醇饲料喂养易于形成腹主动脉易于形成斑块，然而，持续高胆固醇饮食形成的斑块往往以泡沫细胞为主，难以形成与人体类似的复杂斑块。实验研究显示［4-5］，AS本身与血管内皮细胞功能紊乱关系密切相关，内皮细胞受损或功能障碍是AS的始动因素。因此，笔者采用高胆固醇饮食的基础上，行球囊拉伤术损伤腹主动脉内皮细胞，促进斑块形成的数量和严重程度；高胆固醇饮食8周后，改为普通饮食，研究显示降低胆固醇水平，促进斑块不稳定。在此基础上，采用蝰蛇毒和组胺使血管交替强烈收缩和舒张，促进不稳定斑块破裂或糜烂。本研究结果显示，上述模型动物腹主动脉处发生明显的斑块糜烂、破裂和继发血栓形成，与Gang等［6］人的研究类似，提示不稳定斑块继发血栓形成的动物模型制作成功。辛伐他汀可降低上述模型血栓形成，提示辛伐他汀具有抗血栓功效。AS的不稳定斑块易形成血栓，是多种因素共同作用的结果。为阐述辛伐他汀抗血栓形成的机制，本研究利用此模型进一步观察与血栓形成的相关指标的改变。

内皮细胞功能障碍或受损不但是AS始动因素，而且功能障碍和受损的内皮细胞又释放大量的vWF，其具有使血小板与胶原或其他表面黏附的桥梁作用，进而导致AS病变处易形成血栓。本研究显示球囊损伤内皮细胞的动物模型中血浆vWF浓度升高，提示球囊损伤是AS本身和诱导斑块破裂的因素，均导致内皮细胞功能障碍。辛伐他汀有效降低上述动物模型的vWF水平，提示该药抑制血栓形成的机制与保护内皮细胞受损伤有关。

D-二聚体是凝血酶及因子Ⅻ作用下的交联纤维蛋白经纤溶酶降解作用后一种特异性降解产物。可反映凝血和纤溶系统的激活，是目前公认的体内活动性血栓形成的特异性分子的标志物［7］。大量临床研究［8］显示在AS病变中，D-二聚体能沉积于血管壁，直接损伤血管内膜；同时还能促进血小板黏附和聚集，使血液处于高凝状态，进而加速血栓形成。本研究中模型组的D-二聚体检测明显高于假手术组，说明该模型制备后血液处于高凝状态，易于在不稳定斑块中发生血栓形成。而辛伐他汀有效降低了模型动物的D-二聚体浓度，提示该药物可逆转高凝状态，发挥抗血栓功能。

TXB2和6-keto-PGF1α是TXA2和PGI2的稳定代谢产物，以两者含量间接反映半衰期极短的TXA2和PGI2浓度。TXA2和PGI2是一组由血液中血小板和血管内皮细胞释放的血管活性物质，TXA2促进血管收缩和血小板聚集，PGI2舒张血管和抑制血小板聚集，两者相互拮抗。正常情况下在血液中两者含量及比值保持相对平衡状态，使血管舒张有度，既不形成血栓也不发生出血［9］。临床研究［10］发现AS患者血管损伤处有大量血小板黏附，易形成血栓，TXA2增高，而PGI2降低，导致两者平衡失调。一旦两者失衡，则促进血小板聚集，加速血栓形成。本研究实验结果显示，模型组中TXB2增高，6-keto-PGF1α减低，两者比值明显升高，提示该模型血管内皮细胞受损，循环血液中的血小板黏附在损伤部位、被激活、释放TXA2，进一步促进血小板聚集，加速血栓形成。辛伐他汀能有效提高6-keto-PGF1α浓度、降低TXB2浓度，促进两者比例平衡，进一步提示辛伐他汀具有保护内皮细胞、抑制血小板激活进而发挥抗凝作用。

综上所述，本实验通过球囊拉伤术后药物触发制备不稳定斑块血栓形成的模型，进而研究辛伐他汀抗AS的血栓形成的机制，实验结果显示辛伐他汀可能通过修复损伤的血管内皮细胞，改善血液高凝状态，抑制血小板聚集等，发挥抗血栓形成的作用，本研究为辛伐他汀临床针对AS不稳定斑块患者，预防其血栓形成提供了实验依据。

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Effect of simvastatin on thrombosis in unstable plaque thrombosis rabbits model

YANG Lin1，LU Bin1，DU Yun2，GUO Mao-juan1，ZHANG Yun-sha1，LI Hu-hu1，ZENG Wen-yun1，MA Dong-ming1，JIANG Xi-juan1
（1.School of Combination of TCM and WM，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Medical Department，Tianjin Medical College，Tianjin 300222，China）

R541.4

A

1673-9043（2016）01-0019-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.06

国家自然科学基金资助项目（81102699）；天津市自然科学基金资助项目（08JCYBJC10800）。

杨 琳（1978-），女，博士研究生，主要从事中医药防治心脑血管疾病的研究。

姜希娟，E-mail：xijuanjiang@foxmail.com.

（2015-10-30）