盐酸小檗碱与氢氧化钙对白色念珠菌生物膜的体外抑制作用

李福明 汪洋★

盐酸小檗碱与氢氧化钙对白色念珠菌生物膜的体外抑制作用

李福明 汪洋★

目的 评价中药有效成分盐酸小檗碱与口腔常用根管消毒药物氢氧化钙对白色念珠菌生物膜作用的效果。方法 在96孔培养板形成白色念珠菌生物膜，用甲基四氮盐（XTT）减低法检测盐酸小檗碱、氢氧化钙两种药物对白色念珠菌生物膜活性的影响，用结晶紫含量测定法检测两种药物对白色念珠菌生物膜生物量的影响。结果 盐酸小檗碱在浓度为125 mg/L时使白色念珠菌生物膜活性及生物量分别减少（91.6±3.3）%和（94.2±2.5）%，生物膜已基本无活性，抑制效果优于氢氧化钙。结论 盐酸小檗碱对白色念珠菌生物膜具有抑制作用，为口腔根管消毒药物临床应用提供理论依据。

盐酸小檗碱 氢氧化钙 白色念珠菌 生物膜

近20年来，随着癌症放、化疗和器官移植患者的增加，免疫抑制药和广谱抗生素的大量使用，以及插管等医学材料使用的增多，白色念珠菌病的发病率增加近40倍，其中相当一部分与白色念珠菌形成生物膜密切相关。白色念珠菌也是人口腔中的常见共生真菌，其易粘附于植入材料表面，如义齿、种植体及导管，并在其上形成生物膜［1］。寻找以生物膜为靶向的药物是近年的研究热点，国内外研究大都集中在抗生素及抗真菌的化学药物［2］。本研究自2014年5月至2015 年5月探讨中药黄连的主要有效成分盐酸小檗碱对白色念珠菌生物膜抑制效果，为口腔临床治疗真菌感染性疾病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 （1）实验材料：盐酸小檗碱标准品（中国食品药品检定研究院）、脑心浸液琼脂培养基（杭州天和微生物试剂有限公司）、二甲基亚砜（天津市科密欧化学试剂有限公司）、96 孔板、6 孔板（美国BD公司）。（2）试剂：蛋白胨（北京奥博星生物技术责任有限公司），酵母提取物（Oxoid公司）酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基：酵母提取物10.0 g、葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、蒸馏水1000ml，分装后121℃，15min高压灭菌。RPMI 1640培养液（美国GIBCO公司），甲基四氮盐（XTT）粉（上海生工生物工程有限公司），甲萘醌溶液（上海宝泰克生物科技有限公司）。

1.2 实验方法 （1）临床菌株提取鉴定：杭州市口腔医院就诊患者，经诊断为慢性根尖炎病例，无菌纸尖于患牙根管内取样，用CHROMagar CandidaTM鉴定、分离白色念珠菌株。（2）标准白色念珠菌菌液及抗菌剂应用液的配制：从沙堡培养基上取单菌落白色念珠菌接种在YPD（2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）液体培养基中，37℃摇床培养24h，收集YPD培养液中对数期生长状态的真菌细胞，PBS（pH 7.2）冲洗3遍，用RPMI1640（美国GIBCO公司）培养液调整菌悬液浓度为1×107个细胞/ml，OD520nm= 0.38，标准菌悬液制备后即刻使用。将盐酸小檗碱以RPMI1640为溶剂配制成浓度为1000mg/L的原液，按二倍稀释法得到15.63～500mg/L共6个浓度梯度的抗菌剂应用液，一组设计添加菌液加入实验组，另一组设计不加菌液作为阴性对照组。以不加抗菌剂的RPMI1640作为阳性对照组，设计加入菌液。氢氧化钙组用RPMI1640为溶剂配制成10%的饱和溶液（pH 12），将配制得到的菌液分别加入不同浓度的抗菌剂应用液中。阳性对照组同样依照此比值加入等量菌液，而阴性对照组不加菌液。用微量加样器依次取200 μl实验组的抗菌剂应用液，阳性对照组的菌液及阴性对照组的抗菌剂应用液至 96孔微量培养板的微孔中，共设8个复孔，置于37℃恒温培养箱中培养48h。（3）白色念珠菌生物膜活性测定［3］：采用XTT减低法测定生物膜活性，XTT粉末用60℃预热的0.5g/L林格液溶解，0.22μm孔径滤器过滤除菌，分装后-80℃冰箱保存备用。在XTT测定生物膜活性前，加入甲萘醌（以丙酮为溶剂制作1mmol/L的甲萘醌），使其浓度为1mmol/L。白色念珠菌生物膜形成条件同上，培养48h后，弃去培养基，200μl PBS洗涤3次，后每个微孔中加入100μl PBS，用微量加样器取50μl XTT-甲萘醌混合液至每孔中，37℃避光培养2h，酶标仪测OD490nm值，每个药物浓度均有8个孔作为重复，取平均值。（4）生物膜生物量的测定［4，5］：采用结晶紫含量测定法检测白色念珠菌生物膜的生物量。弃去XTT-甲萘醌混合液，200μl PBS洗涤1次，自然干燥后加入结晶紫溶液100μl/孔，染色5min，后弃去结晶紫溶液，200μl PBS洗涤3次，后加入95%乙醇100μl/孔，以微量加样器每孔连续吹吸1min至完全溶解生物膜上的结晶紫，吸取融有结晶紫乙醇转移至另一新96孔微量培养板中，测OD560nm值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。不同浓度抗菌剂的吸光度值比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著法（LSD），检验水准α=0.05，P＜0.05差异有统计学意义。按以下公式计算减少率：减少率= 1-（实验组A值-阴性对照组A值）/（阳性对照组A值-阴性对照组A值）×100%。

2 结果

2.1 不同浓度盐酸小檗碱对白色念珠菌生物膜活性的影响 观察白色念珠菌生物膜形态可见48 h时形成了致密的成熟生物膜。盐酸小檗碱可抑制白色念珠菌生物膜活性，且呈浓度相关性，随盐酸小檗碱浓度的升高，白色念珠菌生物膜活性降低。药物浓度500.00mg/ L，减少率（93.8±4.2）%、250.00mg/L，（94.5±5.8）%、125.00mg/L，（91.6±3.3）%、62.50mg/L，（72.3±4.8）%、31.25mg/L，（63.7±2.5）%、15.63mg/L，（47.8±2.3）%。统计分析表明，盐酸小檗碱在浓度为 125.00 mg/L时使白色念珠菌生物膜活性减少（91.6±3.3）%，生物膜已基本无活性。

2.2 不同浓度盐酸小檗碱对白色念珠菌生物膜生物量的影响 在盐酸小檗碱的作用下，各组的白色念珠菌生物膜生物量均有所减少，且随着盐酸小檗碱浓度的升高，生物膜生物量逐渐减少，药物浓度500.00 （96.3±0.6）%、250.00（95.5±1.4）%、125.00 （94.2±2.5）%、62.50（61.5±3.8）%、31.25（53.7±4.6）%、15.63（48.5±2.3）%。统计分析表明，盐酸小檗碱浓度为125.00 mg/L时使白色念珠菌生物膜生物量减少（94.2±2.5）%。

2.3 两种药物对白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影响 两组作用48h后，盐酸小檗碱浓度为125.00mg/L时对白色念珠菌生物膜具有较好的抑制作用。10%氢氧化钙饱和溶液作用后，生物膜活性减少率及生物量减少率说明白色念珠菌生物膜对饱和氢氧化钙溶液高度耐药，见表1。

表1 两种药物对白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影响±s）

表1 两种药物对白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影响±s）

注：与氢氧化钙组比较，*P＜0.05

组别活性减少率生物量减少率盐酸小檗碱组（125.00 mg/L）91.6±3.3 *94.2±2.5*氢氧化钙组（10%饱和溶液）45.7±4.1 43.4±3.1

3 讨论

白色念珠菌是形成根管生物膜的主要微生物之一。当前，抗真菌药普遍存在毒副作用强、易产生耐药性等原因，因此采用中药治疗越来越受到关注。本实验所采用的盐酸小檗碱为中药黄连中的主要成分。有研究显示黄连解毒汤对白色念珠菌有明显的抑制作用［6，7］。黄连解毒汤复方由黄连等四味药组成，每味中药成分复杂，因此本实验主要研究盐酸小檗碱对白色念珠菌的抑制作用。

本实验采用XTT 减低法检测生物膜活性，各抗菌剂组生物膜活性的减少率总体上呈浓度相关性，说明在盐酸小檗碱影响下，生物膜内存活细胞减少，白色念珠菌生长活力降低。本实验表明当盐酸小檗碱浓度升至125 mg/L时，生物膜活性降低（91.6±3.3）%，说明生物膜已基本无活性。生物膜的生物量采用结晶紫含量测定法检测，各浓度盐酸小檗碱的生物膜生物量都有所下降，且呈浓度相关性，说明在盐酸小檗碱影响下，生物膜的生物量减少。白色念珠菌生物膜活性减低，生物膜的生物量减少说明盐酸小檗碱可抑制体外白色念珠菌生物膜的形成。

实验选用10%氢氧化钙溶液作用于48h白色念珠菌生物膜。由于氢氧化钙是一种较好的根管消毒药物，可通过缓慢释放OH-，提高组织的pH值，破坏细菌的细胞膜而杀菌。要维持较高的组织pH水平，需选用pH值高、流动性好的氢氧化钙。10%的氢氧化钙饱和溶液pH值超出白色念珠菌的质子泵调节范围，可杀灭白色念珠菌，流动性好，溶液中的OH-比氢氧化钙糊剂中的OH-更易渗透至牙本质小管深处，渗透范围更广［8］。盐酸小檗碱浓度为125.00mg/L时对白色念珠菌生物膜具有较好的抑制作用，能杀灭生物膜中的大部分细菌，作用效果优于口腔临床常用根管消毒药物10%氢氧化钙饱和溶液。本实验研究结果说明盐酸小檗碱对白色念珠菌形成具有抑制作用，由于生物膜的形成受多种基因控制，小檗碱抑制白色念珠菌形成的机制，还有待于进一步的研究。

1 张薇，王丹敏，董小青，等.白色念珠菌生物膜对消毒剂抵抗性的研究.武警医学，2011，22（1）：14～16.

2 樊尚荣，刘小平，严冬霞，等.外阴阴道念珠菌病的临床特征和抗真菌药物敏感性研究.中国全科医学，2010，13（90）：3068～3070.

3 Chandra J，Mukherjee PK，Leidich SD，et a1.Antifunga1 resistance ofCandida1 biofi1ms formed on denture acyc1ic in virtro .J Dent Res，2001，80（3）：903～907.

4 Dovigo LN，Pavarina AC，Carme11o JC，et a1.Susceptibi1ity of c1inica1 iso1ates of Candida to photodynamic effects of cur-cumin .Lasers Surg Med，2011，43（9）：927～934.

5 Monterio DR，Si1va S，Gorup LF，et a1.Si1ver nanopartic1es： inf1uence of stabi1izing agent and diameter on antifunga1 activity against Candida a1bicans and Candida g1abrata biofi1ms .Lett in App1ied Microbio1，2012，54（5）：383～391.

6 汪长中，程惠娟，官妍，等.黄连解毒汤对体外白念珠菌生物膜形成的影响.热带病与寄生虫学，2007，5（2）：82～85.

7 汪长中，程惠娟，徐颖，等.黄连解毒汤及其单味药对体外白念珠菌生物膜影响的比较.上海中医药杂志，2008，42（2）：63～65.

8 Va1era MC.Sa1via AC.Maekawa LE，et a1.Antimicrobia1 ana1ysis of ch1orhexidine ge1 and intracana1 medicaments against microorganisms inocu1ated in root cana1s.Minerva Stomato1 ，2010，59（7～8）：415～421.

Objective To investigate the effects of berberine and calcium hydroxide on Candida albicans biofilm formation. Methods XTT reduction assay was performed to determine the effects of berberine and calcium hydroxide on Candida albicans activity. Crystal violet biofilm assay was applied to determine the effects of berberine and calcium hydroxide on the biofilm biomass. Results The reduction rate of Candida albicans biofilm activity and biomass were（91.6±3.3）% and（94.2±2.5）% respectively when the concentration of berberine was 125 mg/L. Berberine possessed better bacteriostatic ability than calcium hydroxide. Conclusion Berberine is proved to inhibit Candida albicans biofilm formation.

Berberine Calcium hydroxide Candida albicans Biofilm

·诊治分析·

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