雷公藤红素对单核/巨噬细胞在舌癌中的影响

赖河青 冯红超★ 宋宇峰

雷公藤红素对单核/巨噬细胞在舌癌中的影响

赖河青 冯红超★ 宋宇峰

目的 探讨雷公藤红素（Tri）对人单核/巨噬细胞系（THP-1细胞）和舌癌细胞（Tca8113）的影响。方法 在酸性微环境中，加入不同浓度的Tri分别与Tca8113细胞、THP-1细胞+ Tca8113细胞、THP-1细胞进行培养24h、48h、72h后，用MTT法检测Tri在不同的浓度下，THP-1细胞对Tca8113的杀伤作用。结果 THP-1细胞单独培养，随着Tri浓度的升高，细胞数量先增加后减少；THP-1细胞+Tca8113细胞混合培养以及Tca8113细胞的单独培养，随着Tri浓度的升高，细胞数量逐渐减少，与浓度成负相关（r=-0.452，P＜0.05）。结论 Tri在低浓度时，能促进THP-1细胞杀伤Tca8113细胞的作用，但浓度过大时，则有明显的杀伤THP-1细胞的作用。

雷公藤红素 单核/巨噬细胞 口腔鳞状细胞癌

肿瘤微环境是肿瘤细胞生长的特殊环境，特点是间质压力高、组织血供不足、营养相对缺乏、高酸低氧等特点［1，2］。在有氧环境下肿瘤细胞仍然进行糖酵解，即所谓的warburg效应，导致生长旺盛的肿瘤细胞伴随大量酸性代谢产物的排出，从而形成肿瘤细胞外的酸性环境［3，4］。Shin等［5］发现雷公藤红素（Tripterine，Tri）明显抑制血管的生成，产生抑瘤作用，甚至可直接杀灭身体内许多恶性肿瘤细胞，同时也具有复杂的免疫调节作用，可以调节单核/巨噬细胞功能。作者自2012年9月至2013年5月，通过体外模拟舌鳞状细胞癌的酸性微环境，在不同浓度的Tri中进行了舌癌细胞与单核/巨噬细胞单独及共同培养，研究Tri对单核/巨噬细胞在舌癌中的影响，为Tri在抗肿瘤方面提供了新的研究方向。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 THP-1细胞株、Tca-8113细胞株、Tri、噻唑蓝（MTT）、RPMI-1640培养液、PBS液、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%含 EDTA胰酶/胎牛血清等。

1.2 方法 （1）配制不同pH值（含2%胎牛血清、20%胎牛血清）的RPMI-1640完全培养液：用5.5%NaHCO3溶液及1N的HCl溶液调配含2%、20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，pH值为6.6、6.8、7.2（在常规条件下配制），配好后-20℃冰箱保存。（2）配制含有不同浓度Tri及调配其不同的pH值：将Tri溶解于少量二甲亚砜（DMSO）配成1mg/ml母液，过滤除菌后分装成1ml/支，-20℃冰箱保存。实验开始前，分别将Tri母液加入含有2%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液中，然后将其浓度调整为0μg/ml、5μg/ ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml，后用5.5%NaHCO3溶液及1N HCl溶液，将其pH调配为6.6、6.8、7.2。（3）复苏冻存的THP-1细胞株、Tca8113细胞株及其细胞悬液的制备：从-196℃液氮中取出冻存管后，迅速将其放入37℃温水杯中，使其快速解冻，擦干后立即放进超净台里面，用吸管将液体吸至15ml的无菌离心管内，再用托盘天平将其平衡后，放入离心机，1500r/min，离心5min，离心结束后，吸管吸弃上清液，再加进pH值为7.2含10%胎牛血清、青霉素100μg/ ml、链霉素100μg/ml的RPMI-1640培养基，直至5ml，用吸管轻柔吹打，使其成为细胞悬液，吹打混匀后将其移至25ml的培养瓶内，在饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中进行培养，利用悬浮换液法，约2～3d时更换新鲜的培养基。（4）MTT检测细胞：培养相应时间之后，在倒置显微镜下进行观察。加入 MTT溶液（5mg/ml）20μl/孔，继续培养4h，1500r/min，离心5min，小心吸净孔内培养液，然后在避光情况下，加入二甲基亚砜150μl/孔，后立即放于摇床上低速振荡，持续时间10min，最终使结晶物能够充分溶解。将酶联免疫检测仪的波长设置为490nm，进行测量，保存吸光度值，同时设调零孔。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件包。MTT实验数据采用正交设计的方差分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tri对THP-1细胞作用后的细胞数量变化 在同一时间段、同一Tri浓度下，随着pH浓度的增加，THP-1细胞数量呈现先增加后减少的趋势，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；在同一pH值、同一Tri浓度下，随着培养时间的增加，细胞数目逐渐减少，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；在同一时间段，在同一pH值下，Tri浓度为0～20μg/ml之间时，THP-1细胞数量逐渐增多，浓度为50μg/ml时，细胞数量则下降明显，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表1。

表1 THP-1细胞培养后细胞数量的变化［μg/ml，（±s）］

表1 THP-1细胞培养后细胞数量的变化［μg/ml，（±s）］

时间（h）pH值Tri浓度0 5 102050 246.60.568±0.112 0.691±0.102 0.795±0.109 0.891±0.111 0.381±0.093 6.80.566±0.113 0.781±0.113 0.894±0.118 0.982±0.103 0.472±0.082 7.20.567±0.102 0.671±0.104 0.789±0.107 0.873±0.113 0.363±0.084 486.60.559±0.115 0.661±0.115 0.748±0.116 0.764±0.104 0.354±0.072 6.80.558±0.107 0.721±0.107 0.767±0.106 0.835±0.116 0.445±0.066 7.20.553±0.106 0.641±0.108 0.656±0.105 0.746±0.105 0.336±0.076 726.60.547±0.108 0.631±0.105 0.745±0.1020757±0.1170.327±0.073 6.80.544±0.109 0.651±0.113 0.754±0.112 0.823±0.108 0.418±0.084 7.20.541±0.104 0.611±0.105 0.719±0.102 0.733±0.112 0.304±0.092

2.2 Tri对THP-1细胞+Tca8113细胞共同培养组作用后细胞数量的变化 THP-1细胞+Tca8113细胞共同培养时，在同一时间段、同一Tri浓度下，pH值由酸至碱，THP-1细胞+Tca8113细胞数量呈现出先增加后减少的趋势，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；在同一pH值、同一Tri浓度下，随时间的增加，细胞数量不断地减少，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；同一时间段和pH值，Tri浓度越高，THP-1细胞+Tca8113细胞的数量出现越少，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表2。

表2 THP-1+Tca8113细胞培养后细胞数量的变化［μg/ml，（±s）］

表2 THP-1+Tca8113细胞培养后细胞数量的变化［μg/ml，（±s）］

时间（h）pH值Tri浓度0 102050 246.60.693±0.107 0.684±0.1020.567±0.1050.558±0.1020.354±0.082 6.80.692±0.106 0.713±0.1120.588±0.1060.569±0.1040.363±0.072 7.20.792±0.103 0.602±0.1080.548±0.1040.536±0.1060.343±0.092 486.60 .783±0.101 0.663±0.1080.557±0.1020.542±0.1070.344±0.073 6.80.784±0.102 0.694±0.1020.576±0.1070.561±0.1090.355±0.074 7.20.775±0.105 0.565±0.1010.535±0.1120.523±0.1120.336±0.082 726.60.766±0.108 0.636±0.1020.543±0.1080.539±0.1010.317±0.092 6.80.757±0.108 0.647±0.1050.562±0.1020.547±0.1030.348±0.085 7.20.748±0.109 0.528±0.1060.521±0.1070.517±0.1050.309±0.076 5

2.3 Tri对Tca8113细胞培养组作用后细胞数量的变化 在培养Tca8113细胞时，随着时间、Tri浓度的增加，pH值由酸性至碱性，Tca8113细胞数量均呈现逐渐下降的趋势，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表3。

表3 Tca8113细胞培养后细胞数量的变化［μg/ml，（±s）］

表3 Tca8113细胞培养后细胞数量的变化［μg/ml，（±s）］

时间（h）pH值Tri浓度0 102050 246.60.566±0.1070.532±0.1020.399±0.108 0.162±0.0210.049±0.007 6.80.567±0.1020.522±0.1120.389±0.104 0.152±0.0320.039±0.006 7.20.565±0.1080.519±0.1050.381±0.106 0.149±0.0220.033±0.009 486.60.564±0.1040.521±0.1080.378±0.103 0.158±0.0210.038±0.008 6.80.561±0.1020.513±0.1090.374±0.102 0.145±0.0230.033±0.012 7.20.562±0.1070.510±0.1050.366±0.101 0.137±0.0120.027±0.011 726.60.561±0.1080.512±0.1060.373±0.106 0.142±0.0370.031±0.009 6.80.553±0.1020.486±0.1070.367±0.105 0.127±0.0180.029±0.007 7.20.520±0.1030.434±0.1060.355±0.104 0.116±0.0190.025±0.005 5

3 讨论

研究表明在肿瘤的生长过程中，会“激活”其周围的间质，这些肿瘤的相关间质又促进肿瘤的发生与进展［6］。当瘤体增大到一定程度后，会出现局部灌注不足、循环差，从而使酸性代谢物乳酸滞留，最终造成局部的pH值降低，出现酸性环境［7］。恶性肿瘤细胞中的pH值大约为7.1～7.2，较相应正常细胞外pH值（7.1～7.6）低［8］，这种酸性微环境减弱了单核/巨噬细胞的杀伤作用，相反增强了分泌血管内皮生长因子（VEGF）等因子的能力，故在酸性微环境中，VEGF使血管内皮细胞增殖，促进了肿瘤内的血管形成［9，10］。微环境中白细胞介素-1等细胞因子也能诱导促使单核/巨噬细胞产生VEGF，从而促进血管的生成。

活化的巨噬细胞包含两种表型：M1经典激活的巨噬细胞（也称M1型或Ⅰ型巨噬细胞），指经过激活后的巨噬细胞，即巨噬细胞的“经典活化”；还有一种叫替代激活的巨噬细胞（也叫M2型或Ⅱ型巨噬细胞），即“替代活化”。M1型以具有增强细胞表面调理素受体以及增强生成活性氧和一氧化氮的能力，以发挥其杀菌和杀肿瘤活性。M2巨噬细胞表达了较高水准的甘露糖受体、清道夫A型受体以及半乳糖受体，同时具有IL-12low等表型。M2功能主要表现为吞噬细胞碎片，并在血管的生成和组织的重建及其修复中发挥重要作用。

本实验采用在不同的pH值、时间以及不同Tri的浓度下，将Tca8113细胞+THP-1细胞共同培养，而以Tca8113细胞、THP-1细胞单独培养作为对照。研究发现，在口腔鳞癌中单核/巨噬细胞的功能转化与局部酸性微环境、Tri干预的浓度密切相关。酸性微环境中，THP-1细胞单独培养，随着Tri浓度的升高，细胞数量先增加后减少； THP-1细胞+Tca8113细胞混合培养以及Tca8113细胞的单独培养，随着Tri浓度的升高，细胞数量逐渐减少，与浓度成负相关（r= -0.452，P＜0.05）；由此可推断单核/巨噬细胞经Tri干预后，可能是其免疫功能表型发生了转化即由促瘤型的M2型转化为抑瘤型的M1型。同样也可以推测得出Tri具有两面性，Tri在低浓度时，能促进THP-1细胞杀伤Tca8113细胞的作用，但浓度过大时，则有明显的杀伤THP-1细胞的作用，这为Tri调节THP-1细胞后达到抗肿瘤的目的，提供了新的研究方向。

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Objective To study the effect of tripterine for the monocytes / macrophages （THP-1） and the common culture of tongue carcinoma （Tca8113） cells in vitro acid microenvironment. Methods In vitro microenvironments，different concentrations tripterine were common cultured with Tca8113 cell，Tca8113 cell+ THP-1 cell，THP-1 cell after 24 hours，48 hours，72 hours . by MTT method to detected change of the number of tongue cancer cells and monocytes / macrophages after to intervente the detection of different tripterine conditions. Results when the monocytes / macrophages were separately cultured，via interfered by different densities of tripterine，the cell counts of Monocytes / macrophages increased and after to reduce. when the monocytes / macrophages and oral squamous cell carcinoma were mixed to culture，and oral squamous cell carcinoma were separately cultured，via interfered by different densities of tripterine，counts of cells was downward trending，and presented significantly inactive related to the densities of tripterine（r=-0.452，P＜0.05）. Conclusion When the concentration of tripterine is lower，the tripterine can promote the increasing of THP-1 cells，however，when the concentration of tripterine is higher，the tripterine can kill the THP-1 cells.

Tripterine Mononuclear-macrophage Oral squamous cell carcinoma

贵州省科技厅计划研究项目［黔科合LG字（2011）001号］

310006 杭州口腔医院（赖河青）

550004 贵州省贵阳市口腔医院（冯红超）

550004 贵州省食品药品监督管理局（宋宇峰）