VEGF-C VEGFR-3对微淋巴管密度的影响及在宫颈癌中的作用

国宏莉 李江华⋆ 王珏 殷姿

VEGF-C VEGFR-3对微淋巴管密度的影响及在宫颈癌中的作用

国宏莉 李江华⋆ 王珏 殷姿

目的 探讨宫颈癌组织及癌旁组织中VEGF-C及其受体的表达对微淋巴管密度的影响及其在肿瘤转移中的作用。方法 采用免疫组化SP法利用抗人D2-40单克隆抗体标记100例宫颈疾病组织中的微淋巴管，并计算癌组织及癌旁组织的微淋巴管密度；采用SP法检测癌组织及癌旁组织的VEGF-C及VEGFR-3蛋白表达，分析二者与微淋巴管密度的关系，评价其在宫颈癌浸润、转移中的作用。结果 D2-40在慢性宫颈炎组织上皮中强阳性表达，宫颈上皮内瘤变中表达逐渐减弱。VEGF-C及VEGFR-3随着宫颈上皮内瘤变级别的增加，表达增强，二者呈高度正相关。结论 癌组织微淋巴管密度的增高与宫颈癌的浸润与转移密切相关，并伴有VEGF-C及受体表达的增强，是反映患者淋巴转移和预后的良好指标。

宫颈癌 VEGF-C 微淋巴管密度 淋巴结转移

宫颈癌是宫颈恶性肿瘤的统称，鳞状细胞癌和腺癌是宫颈恶性上皮性肿瘤的常见组织类型，约占宫颈癌＞90%。淋巴道转移是宫颈鳞状细胞癌和腺癌侵袭远处器官的主要途径之一，而宫颈癌的高病死率与淋巴结转移密切相关。现已证实血管内皮生长因子（VEGF）及其家族成员不仅在肿瘤血管生成，在其它的生理和病理的血管及淋巴管生成中均是必不可少的诱导因子。VEGF-C是VEGF家族的重要成员，与受体VEGFR-3结合，在淋巴管内皮细胞表达。作者通过检测宫颈癌组织及癌旁组织中VEGF-C/VEGFR-3蛋白表达情况，计算微淋巴管密度，分析VEGF-C/VEGFR-3对微淋巴管生成的作用，评价对宫颈癌转移和预后的影响。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2009年11月至2013年10月在湖北医药学院附属人民医院及十堰市妇幼保健院手术切除宫颈组织标本100例，均经病理检查证实。其中慢性宫颈炎8例；宫颈上皮内瘤变Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别12、10、20例；宫颈癌50例，按国际妇产科联盟（FIGO，2000）标准分期，IB2期15 例、ⅡA期17例、ⅡB期18例；按WHO组织学类型分型：腺癌12例、鳞癌36例、腺鳞癌2例；病理分化程度：高分化 6例、中分化29例、低分化15例。术后证实无淋巴结转移31例，有盆腔淋巴结转移19例。患者年龄25～71岁，平均43.7岁。所有宫颈癌患者术前均未放、化疗治疗，宫颈浸润癌行广泛全子宫切除及盆腔淋巴结清扫术。

1.2 试剂 即用型鼠抗人单克隆D2-40抗体（产品编号ZM-0465）、浓缩型兔抗人VEGF-C多克隆抗体（产品编号ZA-0266，工作浓度1：100）、兔抗人VEGFR-3多克隆抗体（产品编号ZM-0277，工作浓度1：100）及通用型SP染色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化SP法 经中性福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈组织连续切片，厚4μm。采用免疫组化SP法检测D2-40、VEGF-C、VEGFR-3的表达情况，操作步骤按试剂盒说明进行。采用枸橼酸缓冲液高压热力修复抗原，DAB显色，苏木精复染。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.4 结果判断标准 D2-40 染色阳性部位主要位于淋巴管腔面胞膜，形成形态不规则的管腔结构，内无红细胞。微淋巴管密度（LVD）的判定参考Aishima等［1］的方法，低倍镜下选择微淋巴管丰富的区域，再转换至高倍镜下，随机选择5个视野，求其平均值，计算LVD。此操作均由两名高年资病理医师完成，取平均值。癌组织微淋巴管密度（I-LVD）及癌旁组织微淋巴管密度（P-LVD）分别判读。VEGFR-3阳性染色主要位于肿瘤边缘及间质微淋巴管内皮细胞质，VEGF-C阳性主要表达于癌细胞胞浆。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0 统计软件。计量资料以（±s） 表示，用t检验。变量间的关系采用相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈组织中D2-40的表达 D2-40在宫颈组织中可表达于微淋巴管内皮细胞，也可表达于宫颈上皮组织（包括鳞状上皮及腺上皮）的基底膜，一般为细胞浆表达（见图1）。各宫颈疾病组织中微淋巴管均可被D2-40标记，镜下呈棕黄色环状结构。慢性宫颈炎中微淋巴管分布少，宫颈上皮内瘤变中微淋巴管数目逐渐增多，部分管腔扩张。在有淋巴结转移的宫颈癌患者中，癌旁组织间见微淋巴管明显增生。D2-40在慢性宫颈炎组织上皮中强阳性表达，宫颈上皮内瘤变中表达逐渐减弱。CINⅡ、CINⅢ级与宫颈浸润癌均为阴性。

图1 宫颈组织中D2-40的表达

2.2 宫颈组织中VEGF-C的表达 慢性宫颈炎中VEGF-C未见表达，随着宫颈上皮内瘤变级别的增加，表达增强，尤其是CINⅠ、CINⅡ与CINⅢ比较差异有统计学意义（P＜0.01），而CINⅢ级与宫颈浸润癌比较差异无统计学意义。VEGF-C主要表达于肿瘤细胞胞浆，局灶分布或弥漫（见图2）。

图2 宫颈组织中VEGF-C的表达

2.3 宫颈组织中VEGFR-3的表达 VEGFR-3阳性染色主要位于肿瘤边缘及间质微淋巴管内皮细胞质，呈棕黄色环状结构，部分在肿瘤细胞内也有表达。慢性宫颈炎中阳性淋巴管的数量较少；随着宫颈上皮内瘤变级别的增加，阳性淋巴管的数量增加，尤其是CINⅠ、CINⅡ与CINⅢ比较差异有统计意义（P＜0.01），各组宫颈疾病间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 VEGF-C、VEGFR-3的表达与微淋巴管密度的关系 宫颈癌组织中随着VEGF-C表达强度的增加，VEGFR-3阳性脉管数也明显增加；而VEGF-C表达阴性者，VEGFR-3阳性脉管数较少。利用Spearman等级相关分析，VEGFR-3的表达与VEGF-C呈正相关 （r=0.753，P＜0.05 ）。另外，癌旁组织微淋巴管密度（P-LVD）与癌旁组织中VEGFR-3的表达呈正相关 （r=0.647，P＜0.05 ）。

3 讨论

VEGF也称血管通透因子 （VPF）或促血管因子（VAS），能特异性地直接作用于血管内皮细胞，是上调血管生成的重要因子。现已证明有6种同源性的VEGF，为VEGF-A，-B，-C，-D，-E和胎盘生长因子（ PIGF）一起构成生成血管因子的VEGF家族。VEGFs尤其VEGF-C、-D，能特异性结合VEGFR-3，促使其磷酸化。VEGF-C与淋巴管上皮细胞有较高的化学亲和性，可以诱导淋巴管上皮细胞增殖和淋巴管的生成，最终导致肿瘤淋巴管转移。但VEGF-C的具体作用机制尚未清楚，有待于进一步研究［2］。

转移是肿瘤侵袭性的重要特征，该过程必须穿过几个屏障，最后在靶器官形成转移瘤。肿瘤组织边缘微淋巴管是肿瘤细胞进入淋巴系统的主要门户，恶性肿瘤细胞主要是通过其周边组织的微淋巴管进入淋巴系统转移。近期有报道，联合D2-40及p16INK4a检测可有效鉴别宫颈上皮内病变，尤其是从宫颈CINⅡ及CIN Ⅲ中筛选出CINⅠ［3］。在对宫颈鳞状细胞的研究中，有学者观察50例患者癌组织中VEGF-C、VEGFR-3及血管生成素-1的表达，分析其与包括转移等临床病理特征的相关性，结果显示微淋巴管生成与淋巴结转移密切相关，而微淋巴管生成与VEGFR-3表达密切相关［4］。部分学者检测宫颈腺癌中微血管密度及微淋巴管密度，结果表明二者在肿瘤的演进和淋巴结转移中起重要作用，而癌旁组织中D2-40标记的微淋巴管密度可作为预测淋巴结转移的独立因素［5，6］。本资料显示，VEGF-C、VEGFR-3随宫颈病变组织级别的增高而表达增强，且与微淋巴管密度正相关，该结果进一步证实了上述研究。由此可见，VEGF-C在淋巴管内皮细胞表达，与瘤周淋巴管生成及淋巴结转移显著相关，这导致肿瘤细胞有更多的机会接触淋巴管，而促进肿瘤细胞淋巴管转移。

Mitsuhashi等［7］对宫颈癌患者血清治疗前后VEGF-C和VEGF浓度比较，研究发现，VEGF-C在治疗前高浓度，经手术或放疗后，二者浓度明显降低，治疗前VEGF-C的高浓度与复发及顽固相关。同时，结果还显示宫颈鳞癌血清浓度明显高于正常人，而腺癌则未见明显区别。另一项研究比较有无淋巴结转移的宫颈癌患者中VEGF-C的表达情况，结果表明淋巴结转移且有VEGF-C升高者，预后不良，1年生存率为38%，而无VEGF-C升高的淋巴结转移者为81%，两组差异有统计学意义［8］。上述研究揭示，在宫颈癌中VEGF-C能促进淋巴道转移，是不良预后的指征。

虽然VEGF能促进肿瘤血管及淋巴管的生成，并可能影响机体的免疫调节功能。但该血管淋巴管不成熟、易渗漏、缺乏周围血管的支持结构，故通过调节VEGF-C、-D和其他相应受体VEGFR-3为靶点抑制肿瘤转移来治疗宫颈癌改善预后，或抑制肿瘤血管的生长促进凋亡，或刺激免疫细胞，增强免疫功能等多途径或治疗方法。如VEGF-C可通过调控树突状细胞的成熟和聚集来影响肿瘤的免疫监视，故肿瘤微环境中的VEGF-C可能抑制与肿瘤相关的树突状细胞诱导抗肿瘤的免疫能力［9］。另一研究显示［10］，通过抑制宫颈癌中VEGF的表达，能增强肿瘤的放射敏感性，从而影响肿瘤放疗效果。而Katanyoo K等［11］的研究认为治疗前血清VEGF的浓度与宫颈癌的临床病理特征如分期分级、肿瘤大小或肿瘤对放疗的疗效等无明显相关性。由此可见，目前应用分子生物学的方法干预肿瘤的转移、免疫等来治疗宫颈癌的途径还存在一定分歧，有必要进一步的研究证实。

VEGF家族成员及受体作为恶性肿瘤淋巴管血管生成的促进因子，其作用机制是目前研究的热点。随着对VEGF作用机制研究的进一步深入，应用分子生物学手段及联合应用传统或更为先进的手段治疗宫颈癌，一定会取得更好的治疗效果。

1 Aishima Shinichi， Nishihara Yunosuke， Iguchi Tomohiro， et al.Lymphatic spread is related to VEGF-C expression and D2-40-positive myofibroblasts in intrahepatic cholangiocarcinoma. Modern Pathology， 2008， 21（3）：256～264.

2 Sotiropoulou N， Bravou V， Kounelis S， et al. Tumour expression of lymphangiogenic growth factors but not lymphatic vessel density is implicated in human cervical cancer progression. Pathology， 2010，42（7）：629～636.

3 Hongxiu Han，Yan Yang，Zhouping Lu， et al.Decreased D2-40 and increased p16INK4A immunoreactivities correlate with higher grade of cervical intraepithelial neoplasia. Diagnostic Pathology，2011， 6：59.

4 Shaleen K. Botting， Hala Fouad， et al. Prognostic Significance of Peritumoral Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3 in Invasive Squamous Cell Cervical Cancer. Translational Oncology，2010，3（3）：170～175.

5 Saad RS， Ismiil N， Ghorab Z， et al. Lymphatic vessel density as a prognostic marker in clinical stage I endocervical adenocarcinoma. int J Gynecol Pathol，2010，29（4）：386～393.

6 Heinzelbecker J， Kempf KM， Kurz K， et al. Lymph vessel density in seminomatous testicular cancer assessed with the specific lymphatic endothelium cell markers D2-40 and LYVE-1：Correlation with pathologic parameters and clinical outcome. Urol Oncol，2013，31（7）：1386～1394.

7 Mitsuhashi A，Suzuka K，Yamazawa K，et al.Serum vascular endothelial growth factor（VEGF）and VEGF-C levels as tumor markers in patients with cervical carcinoma. Cancer ，2005，103 （ 4 ）：724～730.

8 Watanabe S， Kato M， Kotani I， et al.Lymphatic Vessel Density and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Squamous Cell Carcinomas of Lip and Oral Cavity： A Clinicopathological Analysis with Immunohistochemistry Using Antibodies to D2-40， VEGF-C and VEGF-D.Yonago Acta Med，2013，56（1）：29～37.

9 Varney M L，Singh S ，Backora M，et al.Lymphangiogenesis and antitumor immune responses.Curt Mol Med，2009，9（6 ）：694～701.

10 Hu X， Xing L， Wei X，et al.Nonangiogenic function of VEGF and enhanced radiosensitivity of HeLa cells by inhibition of VEGF expression. Oncol Res， 2012，20（2-3）：93～101.

11 Katanyoo K， Chantarasri A， Chongtanakon M， et al.Pretreatment levels of serum vascular endothelial growth factor do not correlate with outcome in patients with locally advanced cervical cancer. Asian Pac J Cancer Prev， 2011，12（3）：699～702.

Objective To research the infl uence and function of the expression of VEGF-C and its receptor on density of lymphatic vessels in cervical cancer. Methods Paraffi n-embedded specimens from 100 patients with cervical diseases were used to measure the expression of VEGF-C and VEGFR-3，marked lymphatic vessels and count density of lymphatic vessels in cervical cancer by S-P immunohistochemical staining method. Results D2-40 was positive expressed strongly in chronic cervicitis tissues epithelium，and weaken gradually. in cervical intraepithelial neoplasia，VEGF-C and VEGFR-3 were enhanced expression with the increase of level of cervical intraepithelial neoplasia，both were highly positive correlation. Conclusion Increase of density of lymphatic vessels in cervical cancer and invasion is closely related to the metastasis，accompanied by VEGF-C and enhancement of the receptor expression，which is a good indicator refl ecting lymphatic metastasis and prognosis in patients.

Cervical cancer VEGF-C Density of lymphatic vessels Lymphatic metastasis

湖北省教育厅基金项目（B2013122；B2015476 ）

442000 湖北医药学院病理学教研室（国宏莉 王珏殷姿）

442000 湖北省十堰市太和医院整形烧伤外科（李江华）