单因素试验优选刺五加多糖的提取条件研究

2016-09-10顾欢欢褚秀玲聊城大学农学院山东聊城252000

山东畜牧兽医 2016年8期

冯跃　高腾　顾欢欢　褚秀玲　苏建（聊城大学农学院　山东聊城　252000）

单因素试验优选刺五加多糖的提取条件研究

冯跃高腾顾欢欢褚秀玲苏建*
（聊城大学农学院山东聊城252000）

刺五加是畜禽生产和保健中常用的一味镇静安神，补气活血的中药。刺五加多糖是刺五加有效成分的重要组成部分。试验通过热水浸提法提取刺五加多糖，采用苯酚-硫酸法测定刺五加多糖的含量，考察单因素刺五加粉碎度、提取溶质、提取pH、浸泡时间和脱脂对刺五加多糖提取率的影响。结果显示，刺五加粉碎度以80目以上，提取溶质选择50%乙醇，提取pH值选择6，浸泡时间选择2h，石油醚脱脂处理，刺五加多糖的提取率最高，达到3.27±0.07%。本试验为刺五加多糖的临床生产提供了理论依据。

刺五加多糖提取单因素

随着畜禽养殖的规模化、集约化发展，中兽药的剂型要求从散剂向更高的剂型，如口服液或颗粒剂转化。中药有效成分的提取方法是影响药效发挥的关键因素。有效成分最佳提取工艺可以最大效率的应用中药，解决目前中药的利用效率低，部分中药供应不足的问题，符合国家生态、节能的发展目标［1］。同时，中药的提取标准化也有利于中药制剂的标准化。

抗生素的禁用和食品安全监管的加强，使中药成为代替抗生素的重要选择之一，同时中药具有绿色、环保、药食同源的功效，更符合养殖业健康养殖和预防为主的观念。刺五加系五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus）的干燥根及根茎，具有扶正固本、益智安神及补肾健脾等功效，该药性温，味辛、微苦［2］。刺五加多糖（ASPS）是刺五加中一类具有生物活性的多糖，其不但具有提高畜禽生产性能的功效，同时还能激活畜禽机体免疫应答，调节机体肠道微生态平衡［3］。但是ASPS在动物生产上的应用研究极为薄弱。ASPS的提取工艺有待进一步优化，本试验在前期的基础上，通过考察单因素对刺五加多糖提取率的影响，从而选择最佳的提取条件以提高ASPS的提取率，减少资源浪费，提高经济效益。

1　试验材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料刺五加饮片（批号：20150507，产地甘肃）购于聊城利民大药房；苯酚、浓硫酸均为分析纯。

1.1.2试验仪器水浴锅、万能粉碎机、离心机、722分光光度计。

1.2试验方法

1.2.1刺五加多糖含量测定方法刺五加多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为标准品（105℃干燥恒重），准确配制浓度为2g/ml的母液，分别稀释浓度为20、 40、60、80、100、120和140μg/ml的标准溶液。分别吸取0、20、40、60、80、100、120和140μg/ml的葡萄糖标准溶液各1ml，加入8个10ml的具塞试管中，然后每个试管中分别加入7%苯酚溶液1ml，最后每个试管沿管壁迅速加入5ml浓硫酸，摇匀，冷水浴5min后，以第一个试管样品为空白对照，在波长490nm处测定吸光度（A）值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析。

1.2.2刺五加的粉碎度将刺五加饮片60℃干燥后，高速粉碎，分别过10、20、40、60目和80目筛。料水比、提取时间和提取温度分别使用实验室已经获得的最佳提取条件［4］，既料水比1∶25，提取温度90℃，提取时间2.5h。分别在5个具塞的锥形瓶中加入2g不同粉碎度的刺五加粉末，加入50ml纯净水，水浴锅90℃水浴2.5h，纱布过滤，滤液适当稀释后在490nm处测定多糖的含量。

1.2.3提取溶剂精确称取2g 80目的刺五加粉末到5个具塞的锥形瓶中，分别加入30%、40%、50%、60%和70%的乙醇50ml。

1.2.4提取液的pH值精确称取2g 80目的刺五加粉末到5个具塞的锥形瓶中，加入50ml的纯净水，用1M HCl和1M NaOH调节pH值分别为5、6、7、8和9 5个梯度。

1.2.5浸泡时间精确称取2g 80目的刺五加粉末到5个具塞的锥形瓶中，按浸泡时间1、2、3、4和5h，加入50ml的纯净水。

1.2.6脱脂处理精确称取2g 80目的刺五加粉末到5个具塞的锥形瓶中，分别加入乙醚、石油醚、丙酮、甲醇和乙酸乙酯各100ml，浸泡24h，过滤，烘干药渣，再加入50ml的纯净水。

1.2.7验证性试验使用以上单因素试验获得的最佳提取条件，对刺五加多糖提取3次，测定刺五加多糖的提取率。

3　结果和分析

3.1葡萄糖标准曲线的建立

以葡萄糖配制标准溶液，采用苯酚—硫酸法测定不同浓度的葡萄糖在490nm处的吸光值，绘制标准曲线。不同标准浓度葡萄糖与对应吸光值的线性回归直线如图1，线性拟合方程为A=0.0095C-0.005，R2=0.9929，试验表明，葡萄糖浓度在20～140μg/ml范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

附图　葡萄糖溶液标准曲线

3.2刺五加粉碎度对多糖提取率的影响

刺五加粉碎度对多糖提取率的影响见表1，由表中数据可见，刺五加多糖的提取率随粉碎度的上升而上升，80目以下最高，10目以上最低，20目、40目和60目相近。药物的粉碎度越高，越有利于有效成分的溶出，但是20～80目之间的差别不大，80目以上，多糖提取率达到最高。考虑到生产中的经济性和实用性，临床生产可以选择40目粉碎，试验室选择80目粉碎。

表1　粉碎度对刺五加多糖提取率的影响　　　　（%）

3.3提取溶剂对刺五加多糖提取率的影响提取溶剂对刺五加多糖提取率的影响见表2，由表中数据可见，刺五加多糖的提取率开始随乙醇浓度的上升而上升，50%达到最高，然后随乙醇浓度的增加而下降。乙醇的极性高于水，随着乙醇浓度的提高，提取液极性增强，有利于溶液渗透到细胞内，但是多糖不溶于乙醇，所以，当乙醇浓度超过50%时，多糖的溶解度下降，导致提取率也降低。临床选择50%乙醇作为提取溶剂最优。