WPC纳米纤维聚合物体外消化性能的研究

程　闻,徐红华,*,董世荣,夏行昊,谭俊艳,张艳杰

(1.东北农业大学食品学院食品质量与安全系,黑龙江哈尔滨 150030;2.东北农业大学黑龙江省乳品工业技术开发中心，黑龙江哈尔滨 150000;3.上海晨冠乳业有限公司，上海 201401)



WPC纳米纤维聚合物体外消化性能的研究

程闻1,徐红华1,*,董世荣1,夏行昊2,谭俊艳1,张艳杰3

(1.东北农业大学食品学院食品质量与安全系,黑龙江哈尔滨 150030;2.东北农业大学黑龙江省乳品工业技术开发中心，黑龙江哈尔滨 150000;3.上海晨冠乳业有限公司，上海 201401)

为了研究纳米纤维聚合物的体外消化性能,本文对不同加热时间下纳米纤维聚合物和常规聚合物性能与指标进行测定,并探讨了胃蛋白酶和胰蛋白酶对2种不同结构聚合物的体外消化作用。结果表明,纳米纤维聚合物的表面疏水性和游离巯基含量比常规聚合物高。在相对较低的酶浓度(E/S为1/30)条件下,与常规聚合物对比,纳米纤维聚合物的水解度较高;但是,增加酶浓度(E/S为1/3)导致的水解度提高幅度远不如WPC常规聚合物,尤其对胰蛋白酶而言,几乎没有任何提高,并且纳米纤维聚合物的水解度要低于常规聚合物的水解度,但对胃蛋白酶而言,酶的添加量的增加依然使纳米纤维聚合物的水解度高于常规聚合物的水解度。对于WPC纳米纤维聚合物形成的3个时期而言,成核期有利于胃蛋白酶的水解,稳定期有利于胰蛋白酶的水解。可以得出结论:体外消化过程中,纳米纤维聚合物更容易被水解。

乳清浓缩蛋白,纤维,聚合,消化,热处理

近年来的研究显示,在低pH(远离等电点)、低离子强度、高温长时间加热条件下,乳清分离蛋白(WPI)、β-乳球蛋白等蛋白能够自组装形成直径几纳米、长度几微米的纤维状聚合物[1]。Durand等人[2-3]研究发现,乳清分离蛋白(WPI)在pH2.0条件下,70～80 ℃加热数小时会形成乳清蛋白纤维结构。Arnaudov等人[4]在2002年报道,在pH2.0和低离子强度条件下,β-乳球蛋白80 ℃加热10～24 h,形成纳米纤维结构。Dave等人[5]也发现在pH2.0和低离子强度条件下,β-乳球蛋白80 ℃加热可以自组装为长链纳米纤维。同时,我们团队前期已经对乳清浓缩蛋白纳米纤维的形成进行了系统研究,确定乳清浓缩蛋白在pH1.8～2.0、90 ℃加热处理10 h以上可形成良好的纳米纤维聚合物[6-7],纤维直径在24～28 nm,对温度、pH、离子强度、热处理时间等条件对纤维形成及纤维直径的影响进行了系统研究,并比较了乳清蛋白纳米纤维与常规聚合物乳化性、起泡性、胶凝性的差异。但迄今为止,对乳清浓缩蛋白纳米纤维的体外消化特性研究甚少。因此,本文采用胃蛋白酶以及胰蛋白酶对乳清浓缩蛋白(WPC)纳米纤维聚合物和常规聚合物进行酶解处理,比较乳清浓缩蛋白2种不同聚合结构的体外消化能力差异,分析纳米纤维在形成不同时期的体外消化能力差异,为乳清浓缩蛋白纳米纤维的应用拓宽新的方向。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验采用的WPC-80来自于美国HILMA公司。

乳清蛋白粉WPC-80(蛋白质76.93%,脂肪1.4%,乳糖5.6%,灰分4.62%,均为质量分数);胃蛋白酶,胰蛋白酶北京索莱宝科技有限公司。

KDN-102C半自动定氮仪上海纤检仪器有限公司;DK-98-ⅡA恒温磁力水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司;F-4500荧光分光光度计日本HITACHI;GL-21M型冷冻离心机上海精密仪器研究所;DELTA320型pH计梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1乳清浓缩蛋白纤维聚合物的制备按照我们前期研究的制备方法进行制备[6-7],将12 g乳清浓缩蛋白(WPC-80)溶于100 mL去离子水,用6 mol/L HCl将溶液的pH调至2.0,14000×g,10 ℃离心20 min,取中间清液,利用凯氏定氮法测定蛋白含量,随即用pH2.0去离子水将蛋白浓度稀释至2 wt%,90 ℃水浴加热(0、1、5、10、15、18、20 h),取样,4 ℃冰箱保存。

常规乳清浓缩蛋白聚合物的制备,除了上述离心前和稀释前两处调pH的地方无需调整,其余步骤同上。即乳清浓缩蛋白在pH2.0和pH6.5加热条件下分别形成纤维聚合物和常规聚合物。

1.2.2表面疏水性参照相关ANS(8-苯氨基-1-奈磺酸)荧光探针法测定[8],并加以改进。用0.01 mol/L的磷酸缓冲液将不同pH、热处理不同时间得到的蛋白溶液稀释成蛋白浓度分别为0. 2 wt%、0.1 wt%、0.05 wt%和0.025 wt%。取已稀释后的蛋白溶液6 mL,加入20 μL 的8 mmol/L ANS溶液,漩涡搅拌均匀,在室温下避光15 min,随即在激发波长为390 nm、发射波长为470 nm和狭缝5 nm的条件下利用荧光分光光度计比色,测定荧光强度,以荧光强度值为纵坐标,蛋白质溶液浓度为横坐标作图,初始斜率即为样品表面疏水性值。

1.2.3游离巯基本实验参照Shimada等人的方法,结合自身实验加以改善[9]。取1 mL不同条件处理后的样品(20 mg/mL),加入至5 mL的Tris-Gly缓冲溶液(0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,0.004 mol/L乙二胺四乙酸,pH8.0和8 mol/L尿素)中,然后在向其中加入20 μL的2,2′-dinitro-5,5′-dithiodibenzoate(DTNB)试剂,震荡混匀,在室温下静止15 min,利用紫外分光光度计在412 nm波长下测定吸光值,以不加DTNB的溶液做空白调零。

巯基含量(μmolSH/L)=(73.53×A412×D)/C

式中:A412-在412 nm下的吸光值,计算时可用平均值;C-固形物含量(mg/mL);D-稀释系数。

1.2.4浊度测定参考Kurganov[10]等人的方法,并加以改善。将蛋白浓度为20 mg/mL的样品溶液用去离子水稀释至2 mg/mL,混匀,在室温条件下利用紫外分光光度计在波长400 nm下测定OD值,用去离子水调零。OD值即为浊度值。

1.2.5乳清浓缩蛋白纤维的体外模拟消化实验

1.2.5.1蛋白酶活力的测定参照中华人民共和国专业标准(SB/T 10317-1999)测定。胰蛋白酶酶活17.9×104U/g,胃蛋白酶酶活力5.4×104U/g。

1.2.5.2单酶酶解反应胃蛋白酶酶解反应:10 mL 2 wt %的蛋白溶液,用1 mol/LHCL调节pH至2.0,定容至25 mL。将胃蛋白酶溶于pH2.0的磷酸盐缓冲溶液中,分别按照酶与底物比(E/S)1/3(以1 g乳清浓缩蛋白质计,添加胰蛋白酶59660.7 U,胃蛋白酶17998.2 U)和1/30的比例加入蛋白酶(以1 g乳清浓缩蛋白质计,添加胰蛋白酶5966.07 U,胃蛋白酶1799.82 U),水浴(37 ℃,100 r/min)消化,反应1 h。反应结束后放入85 ℃水浴锅中灭酶15 min。利用pH-state法测定水解度。水解度DH(%)按下式计算:

其中V是消耗HCL的体积,α是α-氨基酸的解离度,MP是蛋白质量(g),htot是溶质所含的肽键数(meqv/g protein),N是HCL的浓度,本实验中是0.05 mol/L,本实验中α为0.44,htot是8.8[11]。

胰蛋白酶酶解反应:10 mL 2 wt %的蛋白溶液,用1 mol/L NaOH调节pH至7.0,定容至25 mL。将胰蛋白酶溶于pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中,分别按照酶与底物比(E/S)1/3和1/30的比例加入蛋白酶,水浴(37 ℃,100 r/min)消化,反应2 h。反应结束后放入85 ℃水浴锅中酶活15 min。利用pH-state法测定水解度。

1.2.6统计分析实验数据采用Oringin8.0进行作图和Statistix8.0软件对实验数据进行ANOVA进行方差分析。数据均以平均值±标准差表示(n=3)。

2　结果与分析

2.1表面疏水性

在pH2.0和pH6.5两种条件下热处理20 h,样品的表面疏水性产生了较明显的变化(图1)。pH2.0的纤维聚合物表面疏水性显著高于pH6.5条件下形成的聚合物的表面疏水性。随着加热时间的延长,pH2.0的纤维聚合物的表面疏水性呈现先上升后下降的趋势,并且加热5 h时,表面疏水性最大,增加幅度为0 h的38%。与pH2.0的纤维聚合物相比,pH6.5常规聚合物的表面疏水性在整个热处理过程中变化不大,加热5 h后表面疏水性最强,并且表面疏水性的增加幅度仅为0 h的11.98%。并且常规聚合物在加热5 h后表面疏水性的提高量仅为纳米纤维聚合物表面疏水性提高量的24.89%。这种差异可能是因为表面疏水性是纤维形成的主要作用力[12-13],并且在pH2.0条件下,蛋白质所带电荷量较大,产生较大分子间斥力,致使疏水氨基酸暴露程度加大[14]。

图1　不同乳清浓缩蛋白聚合物热处理 过程中表面疏水性的变化Fig.1　The surface hydrophobicities(S0)of WPC at different pH for heating various times注:a～g不同表示同一样品不同加热时间差异显著;A,B 不同表示同一加热时间不同样品差异显著,图2～图5同。

2.2游离巯基

由图2中的结果可知,纤维聚合物在整个形成过程中游离巯基的降低程度明显低于常规聚合物。pH2.0条件下的WPC在加热至20 h时游离巯基含量较0 h的降低了22.2%;pH6.5条件下的WPC在加热至20 h时游离巯基含量较 0 h的降低了57.65%,其中在加热至1 h时,游离巯基由最初的21.11 μmoL/L降至12.70 μmoL/L。与pH2.0的纤维聚合物相比,pH6.5常规聚合物的游离巯基的降低幅度是纤维聚合物的2.60倍。从以上结果可知,在pH6.5 WPC发生常规聚合时,乳清浓缩蛋白主要通过共价的二硫键形成发生聚合,然而,在pH2.0 WPC形成纤维聚合时,二硫键作用是微弱的[7]。

图2　不同乳清浓缩蛋白聚合物 热处理过程中游离巯基的变化Fig.2　The content of free sulfhydryl group(-SH) for WPC at different pH during various times

2.3浊度

在pH2.0和pH6.5两种条件下热处理20 h,随着加热时间的延长,样品的浊度产生了较明显的变化(见图3)。pH2.0的纤维聚合物浊度显著低于pH6.5条件下形成的聚合物的浊度。pH2.0的纤维聚合物在热处理过程中浊度呈现先下降后上升的趋势,并浊度增幅不明显,仅为0 h的1.05倍,而常规聚合物(pH6.5)的浊度值呈明显增大趋势,加热20 h较未加热时的浊度增大了19.50倍。与加热20 h的pH2.0的纤维聚合物相比,加热20 h后的pH6.5常规聚合物的的浊度是纤维聚合物的11.52倍。产生这种差异可能是因为样品在pH6.5条件下长时间加热样品形成较大团簇状聚合物,而在低pH、长时间加热时,球蛋白首先水解为小肽,继而聚合为细丝状的半柔性纤维所致[7]。此结果也可能表明乳清浓缩蛋白在pH2.0形成的纤维聚合速率较常规聚合物的速率慢。

图3　不同乳清浓缩蛋白聚合物热处理过程中浊度的变化Fig.3　The turbidity of WPC at different heating times

2.4WPC纳米纤维体外消化能力的比较

与pH6.5的常规聚合物相比,pH2.0的纤维聚合物具有较高的表面疏水性,游离巯基含量较高,浊度小的特点。WPC纤维聚合物不同于常规聚合物的结构特性,可能导致其体外消化性能也存在很大不同。

图4　不同胃蛋白酶浓度对乳清浓缩蛋白聚合物水解度的影响Fig.4　The effect of pepsin and trypsin concentration on the hydrolysis degree of WPC for heating various times注:a:胃蛋白酶 E/S=1/30;b:胃蛋白酶E/S=1/3;c:胰蛋白酶E/S=1/30;d:胰蛋白酶E/S=1/3。

WPC纳米纤维的形成需要在pH2.0的条件下持续加热10 h以上[4-7],图4比较了纤维的形成期和稳定期的酶解能力,从结果可以看出,在酶浓度(1/30)较低的条件下,WPC纳米纤维聚合物的体外消化能力明显优于常规WPC聚合物,热处理10 h形成纳米纤维后的体外消化能力分别是WPC常规聚合物的1.41倍(胃蛋白酶)和2.09倍(胰蛋白酶)。产生这种结果的原因可能与这两种聚合物的结构特性有关,从浊度的结果可以看出,WPC纤维和常规聚合物的结构存在很大不同(图3),纤维结构中的WPC蛋白质分子充分展开,疏水氨基酸暴露,表面疏水性增强(图1),更利于酶的水解;相反,常规聚合物的团簇状结构,由于蛋白质分子之间存在较多的二硫键,结构相对更紧实,不利于酶的水解。但是,随着酶浓度的增加(E/S为1/3),WPC纳米纤维聚合物的体外消化能力并没有很大提高,从图5的结果可以看出,对胃蛋白酶而言,热处理1 h常规WPC聚合物水解度提升最大,其他增加幅度不大,可能是因为胃蛋白酶对蛋白组分的消化情形与其空间结构紧密相关[15],而纤维在1 h时水解度最大可能是因为,对比于酸水解而言,胃蛋白酶更易攻击具有较高表面疏水性氨基酸和芳香族氨基酸残基[16];并且纤维形成过程中,属于先水解再聚合的过程,在1 h处距离纤维的成核期较近,1 h处水解明显,蛋白质的空间结构改变,暴露出胃蛋白酶酶切位点;而胰蛋白酶的水解结果却发生了明显的变化,增加酶的添加量基本没有导致WPC纳米纤维水解度的增加,作为对照的WPC常规聚合物的水解度却随着酶量增加有大幅度提高,以热处理10 h为例,水解度由原来低于纳米纤维52.11%提高到高出36.01%。这种结果的产生可能与纳米纤维独特的聚合结构有关,β-折叠相互叠加的纤维结构可能是胰蛋白酶不能进一步水解的原因[17]。

表1　纤维不同形成时期水解度相对原始WPC水解度的提高量(%)Table 1　The increase quantity of WPC hydrolysis degree at different heating time(1,5,10 h)compared with native WPC under the same concentration of pepsin and trypsin concentration(%)

注:数据分析通过Statistix 8.1分析,同列字母不同者差异显著(p<0.05);数据以平均值±标准差表示。

图5　蛋白酶改变对纤维不同形成时期水解度的提高量Fig.5　The effect of protease concentration on the improvement percentage of degree hydrolysis of WPC during heating.注:蛋白酶改变指E/S从1/30提高到1/3。

2.5纤维不同形成时期水解能力的比较

纤维的形成主要分为3个时期:成核期(0～2 h)、增长期(2～5 h)和稳定期(5～10 h)[18,7]。3个不同时期WPC纤维聚合物的水解能力也有很大不同,从表中的结果可以看出,与0 h未加热的天然WPC的水解能力相比,胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力存在很大不同。对胃蛋白酶而言,成核期(1 h)的水解能力最强,生长期和稳定期水解能力降低,说明纤维在形成初期有利于胃蛋白酶的快速水解,但是,随着纤维结构的形成则不利于胃蛋白酶的水解;对胰蛋白酶而言,稳定期的水解能力最强,而为具备纤维结构的成核期则不利于胰蛋白酶水解,也就是说稳定期更适合胰蛋白酶水解。

3　结论

WPC纳米纤维聚合物具有较高的表面疏水性、游离巯基以及浊度小等特点。在酶浓度相对较低的条件下,相比常规WPC聚合物,纳米纤维聚合结构更适合胃蛋白酶和胰蛋白酶的快速水解,但是,增加酶浓度导致的水解度提高幅度远不如WPC常规聚合物,尤其对胰蛋白酶而言,几乎没有任何提高。对于WPC纳米纤维聚合物形成的3个时期而言,成核期有利于胃蛋白酶的水解,稳定期有利于胰蛋白酶的水解。

[1]Rita C,Rogert B,Rianne W,et al. Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates inβ-lactoglobulin heat aggregation[J]. Protein Science,2001,10(7):1312-1318.

[2]Gosal W S,Clark A H,Pudney P D A,et al. Novel amyloid fibrillar networks derived from a globular protein:β-lactoglobulin[J]. Langmuir,2002,18(19):7174-7181.

[3]Arnaudov L N,De V R,Ippel H,et al. Multiple steps during the formation of beta-lactoglobulin fibrils[J]. Biomacromolecules,2003,4(6):1614-1622.

[4]Kavanagh G M,Clark A H,Ross-Murphy S B. Heat-induced gelation of globular proteins:part 3. Molecular studies on low pHβ-lactoglobulin gels[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2000,28(1):41-50.

[5]Dave A C,Loveday S M,Anema S G,et al.β-Lactoglobulin Self-Assembly:Structural Changes in Early Stages and Disulfide Bonding in Fibrils[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2013,61(32):7817-7828.

[6]王晶,徐红华. 乳清浓缩蛋白纳米纤维的制备及其界面性质[J]. 中国乳品工业,2013,41(04):19-22.

[7]Gao Y Z,Xu H H,Ju T T,et al. The effect of limited proteolysis by different proteases on the formation of whey protein fibrils[J]. Journal of Dairy Science,2013,96(12):7383-7392.

[8]Hayakawa S,Nakai S. Relationships of Hydrophobicity and Net Charge to the Solubility of Milk and Soy Proteins[J]. Journal of Food Science,1985,50(2):486-491.

[9]Beveridge T,Toma S,Nakai S. Determination of SH-and SS-groups in some food proteins using Ellman’s reagent[J]. Journal of Food Science,1974:39.(1):49-51.

[10]Kurganov B I.Kinetics of protein aggregation. quantitative estimation of the chaperone-like activity in test-systems based on suppression of protein aggregation[J].Biochemistry(Mosc.),2002,67:409-422.

[11]Garrett D A,Failla M L,Sarama R J. Development of aninvitrodigestion method to assess carotenoid bioavailability from meals.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,1999,47(10):4301-4309.

[12]Harper J D,Jr L P. Models of amyloid seeding in Alzheimer’s disease and scrapie:mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins.[J]. Annual Review of Biochemistry,1997,66:385-407.

[13]Rose G D,Wolfenden R. Hydrogen bonding,hydrophobicity,packing,and protein folding.[J]. Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure,1993,22(1):381-415.

[14]鞠婷婷. 酪蛋白对乳清浓缩蛋白纤维形成的干扰及其性质研究[D].哈尔滨:东北农业大学,2014.

[15]何光华,黄俊,尤玉如,等. 乳清蛋白的体外模拟消化过程及热处理的影响[J]. 中国食品学报,2012,12(4):25-29.

[16]Antonov V K. New data on pepsin mechanism and specificity.[J]. Advances in Experimental Medicine & Biology,1977,95:179-98.

[17]Bolder S G,Vasbinder A,Sagis L M C,et al. Heat-induced whey protein isolate fibrils:Conversion,hydrolysis,and disulphide bond formation[J]. International Dairy Journal,2007,17(7):846-853.

[18]Lomakin A,Chung D S,Benedek G B,et al. On the nucleation and growth of amyloid beta-protein fibrils:detection of nuclei and quantitation of rate constants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1996,93(3):1125-1129.

Digestion properties of WPC Namo-fibril aggregatesinvitro

CHENG Wen1,XU Hong-hua1,*,DONG Shi-rong1,XIA Xing-hao2,TAN Jun-yan1,ZHANG Yan-jie3

(1.Department of Food Quality & Safety,College of Food,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Northeast Agricultural Univesity,Harbin 150000,China;3.Shanghai Chen Guan Co.,Ltd. Shanghai 201401,China)

In order to study the properties ofinvitrodigestion of namo-fibril aggregates,the digestion of namo-fibril aggregates and normal aggregates for pepsin and trypsininvitrowas investigated in this paper,and the effect of heating time on the digestion of them were also discussed. The results showed that the surface hydrophobicity and the contents of the free sulfhydyl group of namo-fibrils aggregates were higher than those of the normal WPC aggregates. Compared with normal WPC aggregates,the namo-fibril aggregates had higher degree of hydrolysis at low enzyme concentrate(E/S 1/30). However,the improvement degree of hydrolysis was much less than normal WPC aggregates,especially,no any change was observed with the increase content of the trypsin,and the degree of hydrolysis of the namo-fibrils aggregates was lower than the degree of hydrolysis of normal aggregates,but for the pepsin,the degree of hydrolysis of the namo-fibrils aggregate was higher than that of normal aggregates as the increasing of the amount of enzyme. Nucleation of namo-fibrils was good for hydrolysis of pepsin,while termination of namo-fibrils was good for trypsin hydrolysis during WPC fibril formation three steps. It can be concluded:invitrodigestion process,the namo-fibril aggregates were more easily hydrolyzed.

Whey protein concentrate;fibril;aggregation;digestion;heating

2016-03-03

程闻(1989-)，女，硕士，研究方向：食品科学，E-mail:15114669364@163.com。

徐红华(1969-)，女，博士，教授，研究方向：食品科学，E-mail:xhh3161@126.com。

国家自然基金项目(31471682)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.014