阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用

王　晶,张春丹,杨利敏,解春艳,杜　娟,闫训友,吴智艳，*

(1.廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000; 2.河北省高校食药用菌应用技术研发中心,河北廊坊 065000; 3.廊坊市食用菌技术重点实验室,河北廊坊 065000)



阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用

王晶1，2，3,张春丹1,杨利敏1,解春艳1，2，3,杜娟1，2，3,闫训友1，2，3,吴智艳1，2，3，*

(1.廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊 065000; 2.河北省高校食药用菌应用技术研发中心,河北廊坊 065000; 3.廊坊市食用菌技术重点实验室,河北廊坊 065000)

利用巨噬细胞体外培养体系,研究阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的激活作用。无菌获得小鼠腹腔巨噬细胞,中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;荧光探针标记和Griess反应分别检测细胞内外NO的含量,酶联免疫吸附法检测细胞内一氧化氮合成酶(NOS)、培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素12(IL-12)的含量。结果表明,与空白组相比,25～200 mg/L阿魏侧耳胞外多糖可显著增强巨噬细胞的吞噬活性(p<0.05),增加细胞因子IL-1(p<0.05)和IL-12(p<0.05)的分泌量;50～200 mg/L阿魏侧耳胞外多糖可显著提高细胞NOS(p<0.05)和NO(p<0.05)的含量以及TNF-α的分泌量(p<0.05)。因此,一定浓度阿魏侧耳胞外多糖对体外培养的小鼠巨噬细胞具有激活作用。

胞外多糖,荧光探针,一氧化氮合成酶,白细胞介素-1,白细胞介素-12

多糖广泛分布于动植物和微生物中,是自然界中含量最丰富的大分子化合物之一[1],根据在细胞中存在部位不同,多糖分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖三种,与胞内多糖不同,真菌胞外多糖易与菌体分离,可通过深层发酵获得[2-3]。

阿魏侧耳(Pleurotusferulaelanzi),是一种具有很高食药用价值的担子菌,具有抗肿瘤,提高免疫力[4-5]和延缓衰老等功效[6],阿魏侧耳胞外多糖是从阿魏侧耳液体发酵液中提取的多糖组分[3],目前对于阿魏侧耳胞外多糖生物活性的研究局限在体内研究阶段[7],未有体外激活巨噬细胞及其机理的相关报道。本文利用建立的小鼠巨噬细胞体外培养体系,研究阿魏侧耳胞外多糖对巨噬细胞吞噬和细胞因子分泌等免疫功能的影响作用,为其在食品、药品中的进一步开发利用提供理论支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

阿魏侧耳(PleurotusferulaeLanzi)胞外多糖实验室制备[3];BALB/C小鼠动物许可证号:SCXK(京)2011-0011，北京维通利华实验动物技术有限公司;胎牛血清(FBS)上海生物工程有限公司;DMEM美国Gibco公司;脂多糖(LPS)美国Sigma公司;一氧化氮检测试剂盒、一氧化氮DAF-FM DA探针碧云天生物技术有限公司;小鼠一氧化氮合成酶(NOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)和白细胞介素-12(IL-12)ELISA检测试剂盒美国R&D公司;青霉素和链霉素山东鲁抗医药股份有限公司;实验中所用其他试剂均为分析纯。

MCO-20AIC二氧化碳培养箱日本SONYA公司;FD-1D-50真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司;ZHJH-C超净工作台上海智城分析仪器制造有限公司;BX50系统(荧光)显微镜(配有DP71成像系统)、CKX41SF倒置显微镜日本Olympus公司;MLS-3750高压蒸汽灭菌锅日本SONYA公司;iMark酶标仪美国Bio-Rad公司;Milli-Q超纯水机美国Millipore公司。VCX130超声波细胞破碎仪美国Sonics公司。

1.2实验方法

1.2.1多糖溶液的配制阿魏侧耳胞外多糖用DMEM培养液溶解,0.22 μm针头滤器过滤除菌后得浓度为2 g/L的阿魏侧耳胞外多糖母液,冰箱中冷藏备用。

1.2.2小鼠巨噬细胞的获得及多糖处理参考王晶等[7]方法。小鼠颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡,注5 mL DMEM完全培养液(含10%体积分数的胎牛血清)至腹腔,静置5 min,超净工作台中无菌打开腹腔,收集腹腔液,1500 r/min 离心10 min,弃上清,DMEM完全培养液重悬细胞并接种至培养皿中,37 ℃,5% CO2培养箱培养4 h,弃培养液,磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗去未贴壁细胞,胰蛋白酶消化,收集细胞,1500 r/min 离心10 min,弃上清,DMEM完全培养液重悬后得纯化的小鼠巨噬细胞悬液。台盼蓝染色后计数,调整活细胞密度为5.0×105个/mL分别接种至培养皿或细胞培养板中,多糖处理组添加2 g/L的阿魏侧耳胞外多糖母液,终浓度分别为0、25、50、100、200 mg/L,阳性对照组添加终浓度为20 μg/mL的LPS,置于CO2培养箱中培养。

1.2.3巨噬细胞吞噬能力检测采用中性红法[8]。按上述方法获取、纯化并接种巨噬细胞至96孔细胞培养板中,接种量为200 μL。每组设10个重复孔。培养板用PBS 漂洗3次后,每孔添加终浓度0.075%中性红溶液(无菌PBS配制)100 μL,置37 ℃,5% CO2恒温培养箱中孵育1 h,吸弃上层溶液,PBS 漂洗后加入细胞裂解液(0.01 mol/L冰醋酸与无水乙醇混合液,体积比为1∶1)200 μL,4 ℃静置过夜。酶标仪检测490 nm处吸光值A490 nm。

1.2.4巨噬细胞NO含量测定NO的生成采用荧光探针法检测[9]。按照上述方法获取、纯化并接种巨噬细胞至载玻片(置于培养皿中),待细胞贴壁后,添加足量DMEM(含10% FBS)培养液。每组设3个重复。多糖处理24 h后,收集培养上清,离心后冰箱冷藏备用。取出载玻片,细胞面朝上,添加稀释好的DAF-FM DA探针,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。PBS洗涤细胞三次,充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA探针,加盖洁净的盖玻片后,荧光显微镜观察拍照。

NO含量的测定采用Griess法[10]。依照试剂盒说明,酶标板分设为标准孔、空白孔和待测样品孔,标准孔依次加浓度分别为0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L标准品(NaNO2)溶液50 μL,空白孔加标准品稀释液(DMEM完全培养液)50 μL,样品孔加不同处理组巨噬细胞培养上清,各孔分别添加50 μL Griess Reagent Ⅰ及50 μL Griess Reagent Ⅱ。酶标仪检测540 nm处吸光值A540 nm,根据浓度标准曲线计算样品中NO浓度。

1.2.5一氧化氮合成酶(NOS)含量测定按上述方法获取、纯化和接种细胞至培养皿中,接种量为5 mL。多糖处理24 h后,细胞刮刀刮取细胞,离心,弃上清,磷酸缓冲溶液(PBS)重悬,超声波细胞破碎仪破碎细胞(功率39 W;工作时间3 s,停止时间3 s,共50个循环),离心,收集上清,采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验[10]测定巨噬细胞内NOS含量。

按照试剂盒说明,取出室温平衡20 min后的板条,设置标准品孔、空白孔和样品孔,标准品孔各加入不同浓度的标准品50 μL,样品孔加待测样品10 μL和40 μL样品稀释液,空白孔不加。除空白孔外,标准孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL,37 ℃温育30 min。弃去液体,吸水纸拍干,洗涤液洗涤5次,吸水纸拍干,每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育15 min后每孔加入终止液50 μL,酶标仪检测450 nm波长处各孔A450 nm,根据浓度标准曲线计算样品中NOS浓度。

1.2.6TNF-α、IL-1和IL-12含量测定采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验[11]。取出多糖处理后的巨噬细胞培养上清,按照试剂盒说明操作(方法同1.2.5),根据浓度标准曲线计算TNF-α、IL-1和IL-12含量。

2　结果与分析

2.1阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响

利用中性红法检测巨噬细胞吞噬功能,通过测定细胞内中性红的含量来反映巨噬细胞的吞噬能力。结果显示(表1),培养体系中添加了阿魏侧耳胞外多糖(25～200 mg/L)、LPS(20 mg/L)的巨噬细胞中,中性红的含量显著增加(p<0.05),表明,阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞的吞噬能力有增强作用。

表1　阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响

注:“*”表示与空白对照组相比,差异显著(p<0.05);表2、表3同。

2.2阿魏侧耳胞外多糖对巨噬细胞NO和NOS含量的影响

巨噬细胞在免疫活化或外界信号刺激下,细胞内可诱导型一氧化氮合成酶基因被诱导表达,催化精氨酸氧化成瓜氨酸并产生大量的NO[12]。DAF-FM DA是最新一代用于NO定量检测的荧光探针[13],能够进入细胞并被细胞内酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光,但和细胞内NO反应后可以产生强烈的荧光[14]。荧光结果显示(图1),对照组和添加25 mg/L阿魏侧耳胞外多糖组的巨噬细胞内的荧光较弱,说明两组巨噬细胞可能没有产生NO,细胞内的荧光是DAF-FM自发荧光。而添加50～200 mg/L阿魏侧耳胞外多糖、20 mg/L LPS的巨噬细胞内绿色荧光的强度和平均光密度明显增强(p<0.05)(见图1C～F和图2),表明,添加50～200 mg/L的阿魏侧耳胞外多糖诱导巨噬细胞产生了NO。

图1　NO荧光探针标记的小鼠巨噬细胞(200×)Fig.1　Murine macrophage stained by fluorescence probe for NO(200×)注:A,空白对照组;B～E,25、50、100、200 mg/L阿魏侧耳胞外多糖处理组;F,20 mg/L LPS处理组。

图2　小鼠巨噬细胞中NO荧光探针的平均光密度值Fig.2　Mean optical density of fluorescence probe for NO in murine macrophage注:“*”,表示与对照组相比,差异显著(p<0.05)。

表2　阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞胞外NO和NOS含量的影响

2.3阿魏侧耳胞外多糖对巨噬细胞TNF-α、IL-1和IL-12分泌量的影响

表3　阿魏侧耳胞外多糖对小鼠巨噬细胞多种细胞因子分泌量的影响

正常巨噬细胞(又称为常驻巨噬细胞)处于相对静止状态,很少甚至不分泌细胞因子,可在抗原刺激下发生活化,转变成炎症巨噬细胞,表现为对病原体和肿瘤细胞杀伤活性增强、分泌大量细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-12)等生物活性的变化[16-18]。TNF-α是由巨噬细胞分泌产生的一种多效细胞因子,它具有杀伤或抑制肿瘤细胞、提高机体的免疫调节功能、提高中性粒细胞的吞噬活性以及抗感染等功效;IL-1主要由活化的单核-巨噬细胞产生,可活化胸腺细胞和T细胞,促进B细胞增殖和抗体的分泌,调节机体免疫能力;IL-12 由B细胞和巨噬细胞等产生,具有激活NK细胞、刺激T细胞增殖等作用[19]。由表3可知,随着阿魏侧耳胞外多糖添加量的增加,TNF-α、IL-1、IL-12三种细胞因子的分泌量均呈上升趋势。其中,添加量25～200 mg/L的胞外多糖可显著提高小鼠巨噬细胞IL-1和IL-12的分泌量(p<0.05)。添加量50～200 mg/L的胞外多糖可显著增加小鼠巨噬细胞TNF-α的分泌量(p<0.05)。表明,一定添加量的的阿魏侧耳胞外多糖可活化小鼠巨噬细胞,诱导其产生更多的TNF-α、IL-1、IL-12等促炎细胞因子。

3　结论

本文采用原代培养技术获得大量小鼠巨噬细胞,建立了其体外培养体系,并利用这一体系研究了阿魏侧耳胞外多糖对体外培养的巨噬细胞的激活作用。根据中性红实验、Griess实验和酶联免疫吸附实验,可知添加一定浓度的阿魏侧耳胞外多糖可增强小鼠的吞噬能力,提高巨噬细胞NOS和NO的含量,增加免疫相关细胞因子TNF-α、IL-1和IL-12的分泌量。由此可见,从阿魏侧耳液体发酵液中获得的胞外多糖具有激活巨噬细胞并增强机体细胞免疫的功能,这为阿魏侧耳液体发酵液的进一步开发利用具有一定的指导意义。

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Activation effects of extracellular polysaccharides produced byPleurotusferulaeLanzi on murine macrophage

WANG Jing1，2，3,ZHANG Chun-dan1,YANG Li-min1,XIE Chun-yan1，2，3, DU Juan1，2，3,YAN Xun-you1，2，3,WU Zhi-yan1，2，3，*

(1.College of Life Sciences,Langfang Teachers University,Langfang 065000,China; 2.Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities,Langfang 065000,China; 3.Edible Fungi Key Laboratory of Langfang City,Langfang 065000,China)

The culture system of macrophages was established to investigate the activation effects of extracellular polysaccharides produced byPleurotusferulaeLanzi(IPP)on murine macrophage. Murine macrophages were cultured in sterile environment. Phagocytic activity,the content of nitric oxide synthetase(NOS)and nitric oxide(NO),the levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-1(IL-1),and interleukin-12(IL-12)in culture supernatant were examined with neutral red phagocytosis test,fluorescein labeled probe technique,griess reaction and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively. The results showed that IPP in the range of 25～200 mg/L reduced absorbance of neutral red in cytoplasm(p<0.05),improved the secretion level of IL-1(p<0.05)and IL-12(p<0.05)in culture supernatant. And IPP in the range of 50～200 mg/L increased the content of NOS(p<0.05)and NO(p<0.05),and the secretion level TNF-α(p<0.05). So murine macrophages culturedinvitrocould be activated by IPP at a certain concentration.

extracellular polysaccharides;fluorescein labeled probe;nitric oxide synthase;interleukin-1;interleukin-12

2015-10-09

王晶(1983-)，女，博士，讲师，研究方向：动物细胞工程和生物活性物质，E-mail:oucflora@163.com。

吴智艳(1962-)，女，教授，研究方向：食用菌栽培与深加工，E-mail:lfwuzhiyan@126.com。

河北省高等学校科学技术研究青年基金项目(QN2016019)；河北省高等学校科学研究计划优秀青年基金项目(YQ2013027)；河北省高校食药用菌应用技术研发中心项目(YF201411-321)；河北省高等学校遗传学重点发展学科项目(201221)；廊坊师范学院微生物学重点学科项目(201501)；廊坊师范学院大学生创新训练计划项目(201510100036)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)10-0356-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.065