荞麦对高脂膳食大鼠肝脏中脂代谢相关酶及血清中蛋白的影响

王　丹,张　岚,冯小雨,张洋婷,宋春梅,*

(1.吉林医药学院公共卫生学院,吉林吉林 132013; 2.吉林省中医药管理局二级实验室,吉林吉林 132013)



荞麦对高脂膳食大鼠肝脏中脂代谢相关酶及血清中蛋白的影响

王丹1,2,张岚1,2,冯小雨1,2,张洋婷1,2,宋春梅1,2,*

(1.吉林医药学院公共卫生学院,吉林吉林 132013; 2.吉林省中医药管理局二级实验室,吉林吉林 132013)

本文研究荞麦(buckwheat,BW)对高脂膳食大鼠肝脏脂代谢相关酶及血清蛋白含量影响。将50只成年Wistar雄性大鼠随机分为基础对照组,高脂模型组,荞麦低、中、高剂量组,30 d后取血及肝脏,测定相关指标。结果表明,与基础对照组相比,高脂膳食大鼠体重增加,肝脏肝脂酶(HL)、脂肪酶(LPS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)活性显著降低(p<0.05)。与高脂模型组相比,荞麦高剂量组大鼠体重增加量显著降低(p<0.05);荞麦中、高剂量组LPS、LPL活性显著增高(p<0.05),HL活性降低。各组大鼠血清总蛋白(TP)及白蛋白(ALB)变化差异不显著。相关性分析,荞麦粉剂量与HL、LPS、LPL活性呈现正相关关系,LPL与HL活性呈极显著正相关(p<0.01),LPS与LPL、HL活性呈显著正相关(p<0.05)。综上,荞麦干预高脂膳食可调节机体脂代谢相关酶活性。

荞麦粉,高脂膳食,肝脏肝脂酶,脂肪酶,脂蛋白脂肪酶

随着人们生活水平提高,大多居民饮食结构趋向于高脂膳食,而高脂膳食可诱导机体出现血脂异常、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝等代谢综合征(metabolic syndrome,MS)[1],MS在发生、发展过程中,机体各种代谢及调节均发生着变化,可见高脂膳食对机体具有很大负面作用,因此调整人们的饮食结构尤为重要。

荞麦是一种粮药兼备的粮食作物,目前世界上有多个国家研究都发现荞麦中的活性成分,比如蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、微量元素等,具有较好的保健作用。Merendino N认为苦荞麦芽菜由于含有较高含量有益成分,如芦丁和槲皮素,可作为开发功能性食品的原材料,而且经过实验证明,荞麦芽可以降低血压以及机体的氧化应激,对于治疗慢性疾病具有较好的功效[2]。其中槲皮素成分可改善脑部氧化还原状态,增加海马脑源性神经生长因子的表达,从而改善小鼠的学习和记忆能力[3]。以上可以初步说明荞麦对缓解疾病具有很好的作用。前期研究证明荞麦可作为抗氧化因子,对高脂膳食引起的机体抗氧化活性受损及脂代谢紊乱具有很好的调节作用,因为长期高脂膳食会产生过量的活性氧自由基(ROS),ROS可能会激活一些信号通路导致机体出现严重氧化应激,脂质过氧化程度加重,抗氧化系统调节能力下降,导致血脂显著升高[4]。而荞麦可以通过调节氧化系统进而调节脂代谢紊乱。而脂代谢紊乱主要表现在甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平升高,高密度脂蛋白(HDL)水平降低,可能与脂代谢相关酶及其相关基因表达有直接关系。因此,本文将从脂代谢相关酶角度进一步研究荞麦对脂代谢影响机制,通过构建高脂膳食大鼠模型,研究荞麦粉对大鼠肝脏脂代谢相关酶肝脏肝脂酶(HL)、脂肪酶(LPS)、脂蛋白脂肪酶(LPL)及血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量的影响。为从分子细胞学角度进一步研究荞麦降血脂机制奠定基础,同时为预防和治疗高脂膳食所导致的脑及心血管相关疾病并开发荞麦降血脂产品提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

荞麦(F.esculentumMoench)吉林市市售,粗蛋白含量为9.20%±0.60%,脂肪含量为2.01%±0.30%,水分含量为10.16%±1.03%;胆固醇北京鼎国生物技术有限公司;鸡蛋黄粉吉林金翼蛋品有限公司;猪油吉林市大商超市;LPS、HL、LPL活性测定试剂盒南京建成生物工程研究所;健康成年Wistar雄性大鼠50只,体重(200±20) g,由吉林大学动物实验中心提供,许可证号码为SCXK(吉)-2011-0004。

TD-5A离心机湖南凯达科学仪器有限公司;202-1AB电热恒温干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司;FA1104N电子天平上海精密科学仪器有限公司;722可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司;Selectra XL全自动血生化分析仪荷兰威图;电动玻璃匀浆机天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1高脂模型实验动物分组及给药方式将50只大鼠,随机分为5组,每组10只,分别为基础对照组、高脂模型组、荞麦低、中、高剂量组,每天定时喂食(每200 g体重对应25 g饲料),饮水自由。基础对照组喂食基础饲料,高脂模型组喂食高脂饲料,荞麦剂量组按照1、5、10 g/(kg·d)的低、中、高剂量喂食相应的荞麦,连续饲喂30 d[5]。记录大鼠初始体重和终体重,并记录体重增加量。

各模型组饲料配方如下:

基础对照组饲料配方:玉米粉17.5 kg、大豆粉15.0 kg、面粉12.5 kg、麸皮5.0 kg、葵花子油1.0 kg,另外加多种维生素和无机盐。

高脂饲料配方:基础饲料79%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1%。

荞麦低剂量组:荞麦粉0.8%、基础饲料78.2%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1%。

荞麦中剂量组:荞麦粉4%、基础饲料75%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1%。

荞麦高剂量组:荞麦粉8%、基础饲料71%、蛋黄粉10%、猪油10%、胆固醇1%。

为防止油脂被空气氧化,每周做一次饲料。

1.2.2大鼠中血清及肝组织匀浆液的制备及相关指标的测定血清制备:实验30 d,末次喂养后禁食12 h,不禁水,以10%乌拉坦7 mL/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉,称重,腹腔动脉取血,使用离心机3000 r/min,离心15 min,分离血清,分别测定TP和ALB的含量。

10%组织匀浆液制备:称取肝组织块1 g,放到冰冷生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸吸干称重。加入冷生理盐水9 mL,眼科小剪剪碎,电动玻璃匀浆机匀浆10 min,使用离心机3000 r/min离心10 min。取上清液,分装于EP管中,分别测定肝脏LPS、HL、LPL的活性。测定方法严格按照试剂盒说明书进行操作。

2　结果与讨论

2.1荞麦对高脂膳食大鼠体重的影响

由图1可以看出各组大鼠初始体重无显著差异,在喂养期间,无死亡现象。

图1　荞麦粉对高脂膳食大鼠体重的影响(n=10)Fig.1　Effects of buckwheat on body weight in HFD rats(n=10)注:*表示与基础对照组比较差异显著(p<0.05);#表示与高脂模型组比较差异显著(p<0.05);图2～图6同。

饲喂30 d后,称量各组大鼠终体重发现,与基础对照组相比,高脂模型组大鼠终体重显著增加(p<0.05);与高脂模型组相比,荞麦剂量组大鼠终体重差异不显著(p>0.05)。与基础对照组相比,高脂模型组体重增加量显著增加(p<0.05);与高脂模型组相比,荞麦高剂量组大鼠体重增加量显著降低(p<0.05),荞麦中剂量组大鼠体重增加量降低,但是差异不显著(p>0.05),荞麦低剂量组大鼠体重增加量略有增高,可能是因为荞麦低剂量对大鼠体重减少作用较小,而且大鼠之间存在个体差异。荞麦壳中含有膳食纤维成分,而且膳食纤维是食品营养中的第七大营养元素,对人体健康至关重要。膳食纤维主要是能够促进过饱和状态,抑制食欲[6],另外,膳食纤维能够影响脂肪氧化和脂肪储存[7],从而减少食物摄入来降低体重和体脂。从某种程度上说明了一定剂量荞麦粉能减少机体脂肪的积累,可能具有减缓高脂膳食所引起的体重增加现象。

2.2荞麦对高脂膳食大鼠肝脏中LPS活性的影响

LPS也称三酰基甘油酰基水解酶,它通过作用位点将外源性甘油三酯分解为脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯,其活性强度与冠心病相关[8]。如图2,与基础对照组相比,高脂模型组大鼠肝脏LPS活性下降,而且具有显著性差异(p<0.05),这可能是由于体内摄入脂类物质增多的缘故,对肝脏中LPS活性有一定影响。而LPS活性降低,会导致甘油三酯代谢紊乱。与高脂模型组相比,荞麦组能够增加大鼠肝脏中LPS活性。随着荞麦粉剂量的增加,LPS活性逐渐增高。其中,中、高剂量组效果呈现显著性(p<0.05)。同时也说明荞麦粉能够通过提高LPS活性,促进体内脂肪分解,对防止脂类物质积累有重要意义。

图2　荞麦粉对高脂膳食大鼠肝脏LPS的影响(n=10)Fig.2　Effects of buckwheat on LPS activity of liver in HFD rats(n=10)

2.3荞麦对高脂膳食大鼠肝脏中HL活性的影响

HL存在肝内皮细胞表面,是参与脂蛋白代谢的酶,一方面HL可以协助完成高密度脂蛋白胆固醇(HDL-Ch)的逆向转运,另一方面HL参与LDL的清除,与动脉粥样硬化发生发展有着很大的关系[9]。Itamar Grosskopf等人研究低分子肝素对膳食后代谢过程中机体乳糜微粒清除作用,发现乳糜微粒清除率与HL活性也呈现正相关关系[10]。

如图3,与基础对照组相比,高脂模型组大鼠肝脏中HL活性下降,而且具有显著性差异(p<0.05)。HL的活性降低,可能会降低机体对LDL的清除作用,而且协助HDL-Ch逆向转运的能力减弱。HL调节细胞内脂质贮存消耗会增加脂肪酸的过氧物酶体增生激活受体α及其靶基因的表达,HL在内质网中具有活性且表达增强会导致脂肪酸与三酰甘油及胆固醇酯结合程度显著降低[11]。

图3　荞麦粉对高脂膳食肝脏HL活性的影响(n=10)Fig.3　Effects of buckwheat on HL activity of liver in HFD rats(n=10)

与高脂模型组相比,荞麦低、中剂量组大鼠肝脏中HL活性降低,且具有显著性差异(p<0.05),而且随着荞麦剂量的增加,HL活性逐渐增高,但是低于高脂模型组,可能荞麦对高脂膳食大鼠肝脏中HL活性调节作用并不明显。

2.4荞麦对高脂膳食大鼠肝脏中LPL活性的影响

LPL存在于肝外组织毛细血管内皮细胞表面,主要催化血浆中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯(TG)水解,在CM和VLDL降解中发挥重要作用。相关研究表明体外口服脂肪酶,脂肪酶能明显改善高脂乳剂诱导的大鼠的高三酰甘油和高脂性脂肪肝情况[12]。如图4,与基础对照组相比,高脂模型组大鼠肝脏中LPL活性降低。LPL活性降低表明高脂膳食导致小鼠机体的TG分解能力下降,可以初步推断高脂膳食可能会通过影响机体肝脏脂代谢相关酶的作用,进而导致机体脂代谢紊乱。

图4　荞麦粉对高脂膳食肝脏LPL活性的影响(n=10)Fig.4　Effects of buckwheat on LPL activity of liver in HFD rats(n=10)

与高脂模型组相比,荞麦组能够增高大鼠肝脏中LPL活性。随着荞麦剂量的增加,LPL活性逐渐增高,其中中、高剂量组效果显著(p<0.05)。说明荞麦粉可能会通过提高LPL活性而使CM和VLDL中的TG水解,进而加快脂肪在体内分解速度,减少脂肪在体内的积累,最终可能抑制VLDL、TG水平的升高[13]。前期研究也证明了荞麦粉能够降低高脂膳食大鼠血清及肝脏中TG水平[14]。研究表明LPL是血脂清除和组织摄入脂肪酸的限速酶,它的表达在转录和转译等多个不同水平上严格控制,以应对不同的生理信号刺激。如果膳食脂肪的代谢调控出现问题,将会导致高甘油三酯血症,诱发心血管疾病、胰岛素抵抗和肥胖等相关疾病[15]。

2.5荞麦粉与肝脏脂代谢相关酶活性的相关性分析

由表1进一步得出不同剂量荞麦粉、LPL、HL、LPS四者相关程度。荞麦粉剂量与LPS呈现极显著正相关关系(p<0.01),LPL与HL呈现极显著正相关关系(p<0.01),LPS与LPL、HL呈现显著正相关关系(p<0.05),然而荞麦粉剂量与LPL、HL呈现正相关关系,但是不显著(p>0.05)。

表1　荞麦粉,LPL,HL,LPS之间相关性分析(n=10)

注:*表示相关性显著(p<0.05);**表示相关性极显著(p<0.01)。

2.6荞麦粉对高脂膳食大鼠TP及ALB的影响

TP主要反映肝脏的储备能力。当TP偏高时,说明肝脏储备能力较低,不利于肝细胞修复,以及人体需求。由图5可以看出,五组大鼠血清中总蛋白的含量基本相同,各组之间均没有显著性差异(p>0.05)。可见,虽然30 d高脂膳食对大鼠肝脏脂代谢有较大影响,但是并未导致肝脏储备能力下降以及肝脏相关疾病的发生。然而却不能判断如果继续并且长期高脂膳食是否会影响大鼠肝脏的功能,因此,从血液中TP角度研究高脂膳食对机体肝脏功能的影响以及荞麦对肝脏的保护作用有待进一步探讨。

图5　荞麦粉对高脂膳食大鼠血清中TP含量的影响(n=10)Fig.5　Effects of buckwheat on TP content of serum in HFD rats(n=10)

ALB由肝脏合成,是正常人体血清总蛋白中的主要蛋白质成分,ALB在维持血液胶体渗透压、体内代谢物质运输、营养等方面起着很重要的作用。肝脏疾患时常常检测ALB含量来协助诊断,判断预后。由图6可以看出高脂模型组大鼠血清中白蛋白的含量略低于对照组,但是差异并不显著(p>0.05)。而荞麦剂量组大鼠血清中白蛋白的含量略高于高脂模型组,但是差异也不显著(p>0.05),所以不能说明30 d高脂膳食对大鼠机体中ALB的影响以及荞麦的作用。ALB含量变化程度与肝病的严重程度有关[16],ALB半衰期约为19 d,所以当肝脏病变时,往往要到一定时间和一定的程度时,ALB才能够有一定变化。但是长期高脂膳食对ALB的影响而导致肝脏病变有待于进一步研究。此外,高脂膳食能够引起机体肥胖,肥胖程度越高,氧化应激水平和炎症反应越强,血管收缩活性物质水平越高,造成血压上升[17],相关医疗部门采用多元线性回归模型分析发现ALB与门诊高龄老年人的收缩压及舒张压呈现相关性[18]。由此也可以推断ALB与高脂膳食引起的血压上升可能也存在一定关系,进而可以推断荞麦粉对于高脂膳食引起高血压可能具有一定调节作用,但是对于其作用机制还有待进一步研究。

图6　荞麦粉对高脂膳食大鼠血清中ALB含量的影响(n=10)Fig.6　Effects of buckwheat on ALB content of serum in HFD rats(n=10)

3　结论

本实验通过构建高脂膳食大鼠模型研究荞麦粉对高脂膳食大鼠肝脏中脂代谢相关酶及血清中蛋白含量的影响。与高脂模型组相比,荞麦剂量组大鼠终体重降低(p>0.05);荞麦低、中剂量组体重增加量差异不显著,其中荞麦高剂量组体重增加量显著降低(p<0.05);荞麦粉剂量组大鼠肝脏中LPS及LPL活性增高,其中中、高剂量差异显著(p<0.05);荞麦粉低、中剂量组大鼠肝脏中的HL降低;荞麦粉剂量组血清中的TP及ALB差异不显著。另外对荞麦粉剂量、LPL、HL、LPS之间进行相关性分析,发现荞麦粉与这三项指标都呈现正相关关系,与LPL呈现极显著正相关,LPL与HL呈现极显著正相关关系(p<0.01),LPS与LPL、HL呈现显著正相关关系(p<0.05)。综上所述,用荞麦粉干预高脂膳食,可以通过调节高脂膳食大鼠肝脏脂代谢相关酶作为靶点调节脂代谢,另外通过测定血清中蛋白含量预示荞麦对肝脏保护作用,这是荞麦治疗高脂膳食引起的相关疾病的一个重要作用机理。本研究的结果为今后以脂代谢相关酶为靶点进一步研究荞麦有效成分及其配伍规律,制定以有效成分为质量控制指标的新药质量标准,稳定并提高疗效奠定了基础。

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Effects of buckwheat on lipid metabolism enzymes of liver and protein of serum in high-fat diet rat

WANG Dan1,2,ZHANG Lan1,2,FENG Xiao-yu1,2,ZHANG Yang-ting1,2,SONG Chun-mei1,2,*

(1.Department of Public and Health,Jinlin Medical College,Jilin 132013,China; 2.Lever Two Laboratory of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province,Jinlin Medical College,Jilin 132013,China)

The aim of this study was to point out the effect of buckwheat on lipid metabolism enzymes of liver and protein of serum in high-fat diet rats. Fifty male Wistar rats were assigned randomly to the following groups:control diet,high-fat diet(HFD)and low,medium,high dosage BW group. The relevant index of livers and serum were detected after 30 days. The results showed that weight of HFD group were increased and activity of HL,LPL and LPS were decreased significantly than control diet group(p<0.05). Compared with HFD group,the increasing weight of high BW group rats were decreased(p<0.05),activity of LPL and LPS in medium and high dosage of BW group were increased significantly(p<0.05),activity of HL were decreased. TP and ALB of serum in these groups had no significant difference(p<0.05). BW and HL,LPS,LPL had positive correlation through correlation analysis,LPS had highly significant positive correlation with HL(p<0.01),LPS had significant positive correlation with LPL and HL(p<0.05). In conclusion,BW may regulate the activity of lipid metabolism enzymes by interference high fat diet.

buckwheat(BW);high-fat diet(HFD);lipoprteinlipase(LPL);lipase(LPS);hepaticlipase(HL)

2015-10-19

王丹(1988-),女,硕士,助理实验师,研究方向:植物蛋白工程,E-mail:wangdan19881011@163.com。

宋春梅(1964-),女,硕士,教授,研究方向：营养与慢性病,E-mail:1209816131@qq.com。

吉林省科技发展计划基金(201105089)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)10-0351-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.064