板栗花黄酮的提取工艺及其抑菌活性研究

李月娇,王雪青,*,陈亚蓝,宋文军,王素英,赵国强,付庆伟

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品与生物技术重点实验室,天津 300134; 2.唐山迁西县板栗产业研究发展中心,河北唐山 064300)



板栗花黄酮的提取工艺及其抑菌活性研究

李月娇1,王雪青1,*,陈亚蓝1,宋文军1,王素英1,赵国强2,付庆伟2

(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品与生物技术重点实验室,天津 300134; 2.唐山迁西县板栗产业研究发展中心,河北唐山 064300)

优化半仿生提取(SBE)板栗花黄酮提取工艺,并研究板栗花黄酮的抑菌活性。利用单因素和正交实验优化工艺参数,以抑菌圈及最小抑制浓度(MIC)为指标来评价板栗花黄酮的抑菌效果。结果表明:SBE板栗花黄酮最佳提取工艺为提取时间10 min,提取温度80 ℃,料液比为1∶20(m∶V);在最佳工艺参数条件下,SBE板栗花黄酮的得率为6.76%±0.11%。三种供试菌株对提取的板栗花黄酮的敏感性从大到小依次为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和啤酒酵母菌,最小抑制浓度分别为2、5、6 mg/mL。

板栗花,黄酮,乙醇回流提取,半仿生提取,抑菌活性

板栗是雌雄异花同株植物,板栗花一般指其雄花。板栗雌雄花数量差异大,雌雄花比值可达1∶2349[1],因此,需要人为疏除大量雄花序,特别是近年来,随着板栗种植面积的增加,板栗花的产量十分可观有待开发利用。据报道[2],板栗花有多种生物学功能,民间通过食用治疗喉炎肿痛,捣碎取汁外用治疗漆疮症,用其水煎剂治疗顽固的细菌性痢疾,且具有润肠止泻的功效。研究发现,板栗花中含有黄酮、挥发油、酚酸类、三萜类等多种化合物,其中黄酮类物质含量较高,主要以槲皮素、山奈酚、异鼠李素、杨梅黄酮等游离黄酮与糖基结合形成糖苷的形式存在[3]。黄酮类物质是植物中广泛存在的次生代谢产物,由两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接构成一系列物质,苯环取代基的差异,位置的变化以及氧化程度和酚羟基数量等多样性,使其种类多达9000种,极具保健功能和开发潜力[4-5]。据报道[6],黄酮类物质具有降血脂、降血糖等功能,并对高血压、冠心病、中风等疾病有辅助疗效,可应用于食品、医药等领域。

提取黄酮类化合物的方法有多种。传统的水提法由于提取产物中含有较多的糖、蛋白质等杂质,难以获得高纯度的目的产物;有机溶剂提取法存在有机溶剂残留量大,成本高,提取得率低等问题;超临界流体萃取耗能高,不适合大规模工业生产。根据“相似相容”的提取原理,不同的提取工艺(溶剂种类、提取温度等),不仅会影响总黄酮的含量,而且影响其种类和丰度,进而影响其生物活性。目的产物总黄酮含量一直作为提取工艺评判的重要参数,却很少关注提取工艺对黄酮生物活性的影响。半仿生提取[7](semi-bionic extraction,SBE)法是近年来发展起来的一种分离技术,其原理是通过模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境条件而设计的一种依次经过酸、碱处理的提取工艺,这样使体外提取的黄酮类化合物的种类与体内经胃肠道消化吸收后的黄酮类物质更为相近,能更好地阐述黄酮类物质对机体的生物活性及功能,而且节约成本,安全环保,近年来逐渐取得人们的重视。SBE法已成功应用于蜂胶[8]、杜仲叶[9]、葛根[10]等黄酮的提取。中国已有采用SBE法提取香椿叶[11]、苦参[12]中黄酮的相关报道,但SBE法对板栗花黄酮的提取效果尚未见报道。

本研究先采用单因素和正交实验,研究SBE法提取板栗花总黄酮的工艺;另外,通过对比乙醇回流法(alcohol-reflux extraction,ARE)和SBE法制备的板栗花总黄酮的抑菌活性,得到以抑菌活性为指标的板栗花黄酮合适的提取工艺,为板栗花的综合应用与开发提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

板栗花河北省唐山市迁西县板栗研究发展中心,干燥、粉碎、过筛(80目)备用;大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)天津商业大学微生物保藏中心;芦丁标准品(98%)上海永叶生物科技有限公司;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、石油醚分析纯,天津市风船化学试剂有限公司。

DS-1型高速组织捣碎机上海标本模型厂;ZDHW型调温电热套河北省黄骅市中兴仪器有限公司;T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;RE-52A型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;FD-1A-50型真空冷冻干燥机上海汗诺仪器有限公司;3-18K型离心机德国Sigma-Aldrich公司。

1.2实验方法

1.2.1SBE法提取板栗花黄酮称取一定质量的板栗花粉末以1∶10(m∶V)的比例加入石油醚脱脂2 h后,分别用pH为2.2、7.6、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为浸提剂提取板栗花黄酮,合并滤液以5000 r/min离心10 min,取上清用旋转蒸发器在50 ℃条件下旋蒸30 min得到黄酮粗提液。

1.2.2板栗花黄酮的测定采用文献[13]的方法,得到黄酮与吸光度值的标准曲线为y=10.169x+0.0158,其中R2=0.9971。

移取板栗花提取液1 mL于50 mL容量瓶中,加入5%(m/V)的NaNO3溶液2 mL,摇匀,静置6 min;加入10%(m/V)的Al(NO3)3溶液2 mL,摇匀,静置6 min;加入4%(m/V)的NaOH溶液20 mL摇匀,静置6 min,加蒸馏水定容,摇匀,5000 r/min离心10 min,取上清在510 nm处测定其OD值。根据标准曲线可以得到板栗花黄酮的浓度C,根据公式(1)求得板栗花黄酮的提取得率R。

式(1)

式中:R-板栗花黄酮提取得率,%;C-提取液黄酮的浓度,mg/mL;V-提取液定容体积,L;m-板栗花粉末的质量,g。

1.2.3SBE法提取板栗花黄酮的实验设计

1.2.3.1单因素实验设计提取时间对提取得率的影响:固定提取温度为70 ℃,料液比为1∶20(m∶V),考察不同提取时间(10、20、30、40和50 min)对提取得率的影响。

提取温度对提取得率的影响:固定料液比为1∶20(m∶V),提取20 min,考察不同提取温度(50、60、70、80、90 ℃)对提取得率的影响。

料液比对提取得率的影响:固定提取温度为70 ℃,提取时间为20 min,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 m∶V)对提取得率的影响。

1.2.3.2正交实验设计SBE法以提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)为实验因素,按照L9(34)正交表进行实验,优化SBE法的提取工艺。

表1　SBE法的正交实验因素水平表

1.2.4板栗花黄酮的抑菌圈实验将烘干的滤纸片(直径9 mm)均匀浸泡于分别以优化ARE和SBE两种工艺提取的板栗花黄酮提取液(总黄酮含量为100 mg/mL)中,并置于含菌平板。含真菌平板28 ℃生化培养箱中培养48 h,含细菌平板37 ℃生化培养箱中培养24 h,之后测定抑菌圈直径。当抑菌圈直径范围在9 mm<抑菌圈直径<10 mm时,为低度敏感;在10 mm<抑菌圈直径<20 mm时,为中度敏感;而抑菌圈直径>20 mm为高度敏感,并以无菌水为对照组[13]。

1.2.5板栗花黄酮的最低抑菌浓度(MIC)的确定分别制备浓度为0、1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的含药平板,吸取100 μL浓度为106cfu/mL的菌悬液加入含药平板中,用无菌涂布棒涂抹均匀,分别置于相应温度的培养箱中培养。

2　结果与分析

2.1SBE法中不同提取工艺参数对黄酮提取得率的影响

2.1.1提取时间对提取得率的影响提取时间对提取得率的影响见图1。

图1　提取时间对总黄酮提取得率的影响Fig.1　Effects of extracting time on extraction yield of total flavones

由图1可知,在10～20 min时间范围内,提取得率从5.05%±0.07%增加至5.83%±0.12%,之后提取得率随时间增加而降低。黄酮类化合物在酸性条件下比较稳定,但在碱性环境下,一些黄酮的稳定性变差,如花色苷在弱碱性条件下长时间受热,花色素苷母核结构首先转化为查尔酮式结构,随后查尔酮式结构降解,黄酮结构被破坏,导致提取得率降低[14-20];也可能是由于提取时间过长,杂质溶出增多导致提取得率降低,因此,最佳的提取时间为20 min。

2.1.2提取温度对提取得率的影响提取温度对提取得率的影响见图2。

图2　提取温度对总黄酮提取得率的影响Fig.2　Effects of extracting temperature on extraction yield of total flavones

由图2可知,在一定范围内,板栗花黄酮提取得率随提取温度的升高呈先增大继而减小的趋势,当温度在60～70 ℃之间,提取率随着温度的升高而显著增加(p<0.01),当温度高于70 ℃,提取得率升高趋势开始平缓(p<0.05),至80 ℃时,提取得率达到最大(6.30%±0.10%)之后,迅速下降。

温度是能够显著改变溶液中物质溶解度的一个因素,提高溶剂温度,分子运动速度加快,渗透、扩散、溶解速度均加快而且可引起细胞膜结构的变化,使黄酮类化合物由板栗花外层细胞转移到溶剂中,因此,能够有效的提高黄酮类物质的浸出量。但温度过高,会引起分解反应的加剧,导致总黄酮提取得率下降。诸爱士[21]在研究葛根黄酮提取时发现,温度的影响具有双重性,升高温度可以降低液体黏度,使传质阻力减小,同时可以促进分子热运动,提高扩散系数,并增加溶质的溶解度,有利于提取得率的提高,但温度过高又会使物质分解变性,降低提取得率。因此,合理的控制提取温度在70～80 ℃,在黄酮提取工艺中是十分重要的。

2.1.3料液比对提取得率的影响由图3可知,随料液比的增大,板栗花黄酮的提取得率升高。料液比为1∶20(m∶V)时,提取得率达到6.27%±0.12%,而后提取得率增加缓慢,逐渐趋于稳定。分析原因可能是料液比过低,提取液与板栗花粉接触不够充分,黄酮的溶解度太小;随料液比的增大,黄酮的溶解度增大,提取得率增大,料液比过高,造成能源的浪费。综合考虑,1∶20(m∶V)为板栗花黄酮提取的最佳料液比。

图3　料液比对总黄酮提取得率的影响Fig.3　Effects of ratio of material to extractant on extraction yield of total flavones

2.2SBE法的提取工艺优化

2.2.1SBE法的提取工艺优化由表2极差分析可知,因素影响主次为A>C>B,最佳配比为A3B1C2,即提取温度80 ℃，提取时间为10 min,料液比为1∶20(m∶V)。由表3可知,温度对板栗花黄酮提取得率的影响显著,各因素影响主次为A>C>B。

表2　SBE法的正交实验结果表

表4　板栗花黄酮的最低抑菌浓度(MIC)实验结果

注:“++”代表有较多菌生长,“+”代表有少量菌生长,“-”代表无菌生长。

表5　板栗花黄酮的抑菌圈实验结果

表3　方差分析表

2.2.2验证实验为进一步验证优选SBE工艺的可靠性,分别取3份板栗花粉,每份20.00 g,按上述最优工艺条件进行验证实验,所得黄酮平均提取得率为6.76%±0.11%。

按照文献报道的ARE工艺,考察了乙醇浓度、提取时间和料液比对提取得率的影响,并进行了正交实验,得到的工艺参数与文献报道的相一致[22]，即:乙醇浓度80%、提取时间1.5 h、料液比1∶20。在此工艺参数下,分别取3份板栗花粉,每份20.00 g,所得黄酮平均提取得率为6.62%±0.07%。

2.3板栗花黄酮的抑菌活性实验结果

由表4可知,三种菌对板栗花黄酮的敏感程度顺序依次为:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),大肠杆菌(E.coli),酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae);SBE法提取的黄酮的抑菌效果优于ARE法。

由表5可知,采用SBE法提取的板栗花黄酮的抑菌圈直径大于ARE法(p<0.05),三种菌对板栗花黄酮的敏感程度顺序依次为:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。

黄酮类化合物具有抗菌活性,其抗菌活性的大小与其来源和黄酮的精细结构有关,如羟基的数目及取代位点的差异对黄酮类化合物的抑菌活性产生影响[23]。而提取方法的不同,有可能会改变物质的组成。本研究通过采用ARE法和SBE法得到的黄酮来比较对大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的抑制作用,其抑菌程度从大到小依次为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)>大肠杆菌(E.coli)>酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae),而且采用SBE法得到的黄酮的抑菌活性大于ARE法,这可能正是由于SBE的酸碱环境使板栗花黄酮中的一些基团发生改变,从而改变了其抑菌活性。王瑞[24]等对苗药八爪金龙半仿生提取物进行抑菌活性研究时发现,SBE法提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的抑菌活性高于ARE,与本实验结果相似。因此SBE法提取黄酮时间短,效率高而且活性好,是一种行之有效的提取方法,因而有着广阔的应用前景。

3　结论

优化的SBE提取工艺参数为:提取温度80 ℃、提取时间10 min和料液比1∶20(m∶V),在优化的工艺条件下提取板栗花黄酮,提取得率达到6.76%±0.11%,同时显示板栗花黄酮具有一定的抑菌效果,三种供试菌株对提取的板栗花黄酮的敏感性从大到小依次为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae),最小抑制浓度分别为2、5、6 mg/mL。与ARE法比较,SBE法最大的优势在于处理时间短。本实验显示,板栗花处理时间仅为10 min,远远小于ARE法所经历的1.5 h加热时间;而且提取剂以水取代了有机溶剂乙醇,因此SBE法提取黄酮物质不仅提高了产量,更重要的是提高了抗菌活性,而且也降低了生产能耗和对环境友好。

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Optimization of technologies for extracting flavones from chestnut flower and its antibacterial activity

LI Yue-jiao1,WANG Xue-qing1,*,CHEN Ya-lan1,SONG Wen-jun1, WANG Su-ying1,ZHAO Guo-qiang2,FU Qing-wei2

(1.Institute of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China; 2.Qianxi Chestnut Industry Research and Development Center,Tangshan 064300,China)

Technological parameters of semi-bionic extraction(SBE)flavones from chestnut flower were optimized using single factor and orthogonal experiment,and the antibacterial activity of the flavones was investigated by measuring the inhibition zone and the minimum inhibitory concentration(MIC). The results showed that the optimum extracting conditions were extracting time 10 min,the temperature 80 ℃ and material-to-liquid ratio 1∶20(m∶V). Under these optimal conditions,the extraction yield of(6.76%±0.11%)were obtained. The flavones from chestnut flower exhibited the antibacterial activity againstE.coli,BacillussubtilisandSaccharomycescerevisiae. The orders from strong to weak wereBacillussubtilis,E.coliandSaccharomycescerevisiae. The minimum inhibition concentration of the flavonoids was respectively 2 mg/mL,5 mg/mL and 6 mg/mL.

chestnut flower;flavones;alcohol-reflux extraction;semi-bionic extraction;antibacterial activity

2015-10-26

王雪青(1964-)，女，博士，教授，主要从事天然活性物质方面的研究与开发，E-mail:wxqing@tjcu.edu.cn。

李月娇(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：天然活性物质的研究与开发，E-mail:270696347@qq.com。

天津市高等学校创新团队建设规划资助项目(TD12-5049)；天津市高校科技发展基金资助项目(20120603)；唐山迁西县板栗产业研究发展中心资助项目(G11034)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)10-0298-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.052