不同酶水解对鸡蛋清蛋白降解和潜在致敏性的影响

王　艳,龙彩云,夏佳恒,杨安树,*,陈红兵

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047)



不同酶水解对鸡蛋清蛋白降解和潜在致敏性的影响

王艳1,2,龙彩云1,2,夏佳恒1,2,杨安树1,2,*,陈红兵1,2

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西南昌 330047)

酶水解是降低食物过敏原致敏性的一种常用手段,本文分别利用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解鸡蛋清蛋白,通过三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE),并结合水解度(邻苯二甲醛法)分析监测蛋清蛋白的酶解过程,进一步利用制备的兔抗蛋清蛋白多克隆抗体血清和鸡蛋过敏患者血清池评估酶解产物的抗原性和致敏性。结果表明:木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶能够有效的水解蛋清蛋白,并且所得酶解产物的抗原性和致敏性较低,其中,木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后产物的抗原性降低了59.23%,致敏性降低了4.91%;碱性蛋白酶水解蛋清蛋白后产物的抗原性降低了57.61%,致敏性降低了4.55%。因此,木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对鸡蛋清蛋白降解及致敏性降低方面均有显著影响。

蛋清蛋白,酶水解,鸡蛋过敏,降解,潜在致敏性

我国的鸡蛋产量位居世界第一,鸡蛋营养价值高,蛋白含量丰富,其蛋清蛋白约占蛋清质量的10%～12%,含有人体所必需的多种氨基酸,是一种理想的蛋白质资源[1]。但是,鸡蛋也是一种常见的过敏食物,位居食物过敏排行榜的第二位[2-5]。据流行病学调查表明,鸡蛋过敏占婴幼儿和儿童食物过敏的35%[6],占成年人食物过敏的12%[7]。目前公认的鸡蛋主要过敏原有6种,分别是溶菌酶(Lys,Gal d4)、卵类黏蛋白(OVM,Gal d1)、卵转铁蛋白(OVT,Gal d3)、卵白蛋白(OVA,Gal d2)、α-卵黄蛋白(α-livetin,Gal d5)和卵黄糖蛋白(YGP42,Gal d6)[8-10],其中卵类粘蛋白(Gal d1)、卵白蛋白(Gal d2)、卵转铁蛋白(Gal d3)和溶菌酶(Gal d4)存在于蛋清中[11-13]。迄今为止,鸡蛋过敏尚无特效疗法,严格避免食用含鸡蛋的食物是过敏患者的最佳选择。但完全避免食用鸡蛋很困难;而且容易造成鸡蛋过敏患者营养不良和膳食结构紊乱。目前,主要通过热处理、酶解法、糖基化反应及发酵等加工方法降低鸡蛋致敏性,在这些加工方法中,酶解被认为是降低食物致敏性最有效的方法之一[14]。

蛋白质酶解是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解,使大分子蛋白降解成不同链长的小分子,引起蛋白质结构变化。研究发现酶解不仅可以降低鸡蛋蛋清蛋白致敏性,而且酶解生成的寡肽更易于被人体消化吸收,大大提高了鸡蛋蛋清蛋白在食品工业中的应用范围[15-16],与原蛋白相比,水解产物的溶解性、起泡性及黏度等功能特性得到了改善,且具有降血脂、降血压和抗氧化等生理活性[17-20]。当前,关于鸡蛋清蛋白酶解产物的功能性和生理活性研究较多,而针对其酶解产物的抗原性和致敏性研究还相当缺乏。

因此本文利用不同蛋白酶水解蛋清蛋白,通过邻苯二甲醛法和Tricine-SDS-PAGE电泳检测酶解产物的水解度和分子量分布;同时,以蛋清蛋白为抗原,通过皮下多点注射免疫日本大耳兔,制备出特异性较高的抗蛋清蛋白多克隆抗体血清;进一步利用制备的多抗血清和过敏患者血清池评估水解产物的抗原性和致敏性,筛选出降低血清蛋白致敏性效果较佳的蛋白酶。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

红壳鸡蛋江西省南昌市青山湖区天虹商场;日本大耳兔饲养于江西省实验动物质量监测站,饲养过程中确保食物中不含有任何鸡蛋成分,饲养一周无异常后,准备免疫,免疫之前采集阴性血清;鸡蛋过敏患者血清广西医科大学第一附属医院;牛血清白蛋白(BSA)标准品、40%凝胶贮液、小分子蛋白Marker、二硫苏糖醇(DTT)上海生工;弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG二抗、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、邻苯二甲醛(OPA)、生物素标记羊抗人IgE二抗Sigma公司;中性蛋白酶、碱性蛋白酶诺维信公司;HRP-链霉亲和素欣博盛公司;蛋清蛋白的CAP、校正用CAP瑞典法玛雅公司;其它常规试剂均为分析纯。

Mode 680型酶联免疫检测仪、蛋白电泳仪美国BIO-RAD公司;HJ-A6型恒温磁力搅拌水浴锅常州迈科诺仪器有限公司;ImmunoCAP仪器瑞典法玛雅公司;TU-1901型紫外分光光度计日本日立公司。

1.2实验方法

1.2.1蛋清蛋白分离方法参考佟平[21]并稍作改进。取红壳鸡蛋,用分蛋器分离蛋清与蛋黄,玻璃棒轻搅至蛋清中无胶状物质后,加入等体积的蒸馏水稀释,用1 mol/L HCl调pH至6.0,除去蛋清中的卵黏蛋白。4 ℃下连续搅拌3 h,2500×g下离心30 min,取上清,同时利用考马斯亮蓝法测其蛋白浓度,于-20 ℃下保存备用。

1.2.2抗蛋清蛋白多克隆抗体的制备方法参考杨苗等[22]并稍作改进。选取2只8周龄大的雄性日本大耳兔,质量约为25 kg,分别标记为1#和2#,首次免疫将弗氏完全佐剂(CFA)与等体积蛋清蛋白乳化后于背部皮下多点注射免疫兔子,免疫剂量为200 μg/只,之后每隔两周以弗氏不完全佐剂与等体积蛋清蛋白乳化后免疫兔子,剂量为200 μg/只,共免疫6次。前期采用耳缘静脉取血,在第12周对2只兔子进行股动脉采血,每次取血后分离血清,利用间接ELISA方法和考马斯亮蓝法分别测定大耳兔血清抗体效价和浓度。效价指的是抗原抗体反应时,出现明显反应终点的抗血清或抗原制剂的最高稀释度。

1.2.3蛋清蛋白的酶解方法参考金晓君[23]并稍作改进。将蛋清用0.02 mol/L pH为7.2磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度后,用2 mol/L NaOH调pH至10.0,转入沸水浴中使其迅速升温至85 ℃,并水浴保温30 min,取出,冷却至室温。选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为水解酶,以5000 U/g的比例加入蛋白水解酶,分别在酶各自最适温度及最适pH下(见表1)进行水解,一定时间后取出样品,并高温钝化酶以终止水解反应。1个酶活力单位指在测定条件下,每分钟水解酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在275 nm波长的吸光度与1 μg酪氨酸的吸光度相当时所需的酶量,以(U/g或U/mL)表示。

表1　蛋白酶活性、最适温度及pH

1.2.4酶解蛋清蛋白水解度和分子量的测定

1.2.4.1酶解蛋清蛋白水解度的测定酶解过程中水解度的测定采用Church[24]的邻苯二甲醛(OPA)法并加以改进。具体方法为:以精氨酸作为标准品,绘制标准曲线。取400 μL样品溶液加入到盛有3 mL OPA的离心管中,混匀5 s,避光反应2 min,同时做空白对照实验,未水解样代替,340 nm下测定吸光值,按标准曲线计算水解度如下:

h=(ht-hc)×DFDH(%)=h/htot×100

式中,ht-样品的吸光度从标曲上查得的浓度;hc-对照品(未水解样品)的吸光度从标曲上查得的浓度;htot-全部酶解液的吸光度从标准曲线上查得的浓度;DH-样品的水解度;DF-样品的稀释倍数。

1.2.4.2酶解蛋清蛋白分子量的测定方法参考Kasera R[25]和Schägger H[26]并稍作改进。酶解产物分子量通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测,具体步骤如下:分别取10 μL不同时间点收集的水解物与等体积的上样缓冲液混匀,于恒温孵育器中100 ℃孵育5 min,取出离心,上样15 μL进行Tricine-SDS-PAGE电泳。浓缩胶的电泳条件为30 V、1 h,分离胶(夹层胶和致密胶)的电泳条件为100 V、2 h。

1.2.5蛋清蛋白过敏患者血清池的构建方法参考Johansson S G O[27]。从收集的食物过敏患者血清中挑选出14个疑似鸡蛋过敏患者血清,采用ImmunoCAP仪器分别测定这些血清对蛋清蛋白的特异性IgE值。将呈轻度过敏以上的血清按等体积混合,得到蛋清蛋白过敏患者血清池。另外,阴性对照的血清取自对鸡蛋不过敏的正常健康者。

1.2.6抗原性与致敏性的评估采用竞争抑制 ELISA 检测不同的蛋清蛋白酶解产物与兔多克隆抗体 IgG和过敏患者血清IgE的结合能力。抗原性IgG的检测方法参考Tong[28],致敏性IgE检测方法参考Ma[29]。

IgG(或IgE)抑制率(%)=(1-B/B0)×100

B:有竞争蛋白对应的OD值;B0:无竞争蛋白时的OD值。

抑制率越高时,表明该竞争蛋白残余的IgG/IgE反应性越强,即抗原性/致敏性越强。

1.2.7数据处理与统计分析所有实验至少重复三次,数据分析采用SPSS统计分析软件,如不特别说明,结果用平均值±标准偏差表示。统计显著性分析用单因素方差分析,以p≤0.05表明具有显著性。不同的小写字母(柱状图上方)表示显著性差异。

2　结果与讨论

2.1抗蛋清蛋白兔多克隆抗体的制备

免疫过程中抗血清效价的变化见图1。从图1中可知,随着免疫次数的增加,抗血清效价也随之上升,到第十周时(p≤0.05),抗血清效价将不再上升,因此,在第12周对2只兔子进行股动脉采血,分离血清,最终得到血清抗体的效价为50000。

图1　免疫过程中抗体效价变化Fig.1　Change of the antibody titer during immunization

抗原的纯度越高,一般制备的多克隆抗体的效价越高[21]。本研究中,由于蛋清蛋白不是单一蛋白,而是多种蛋白的混合物[12]。因此所制得的多克隆抗体效价达50000。同时,抗原的免疫剂量也能影响免疫抗体的产生,剂量过低,不能引起足够强的免疫刺激;若免疫剂量过多,有可能引起免疫耐受,或者导致动物的死亡。在0～8周时,抗体的效价随着免疫剂量的增加而增高。免疫剂量与免疫周期也有关,两次注射的间隔时间若太短,则起不到再次免疫的效果,太长则又失去了前一次激发的敏感作用。在本实验中采取隔两周对家兔进行一次免疫。

2.2Tricine-SDS-PAGE电泳分析结果

蛋清蛋白经4种蛋白酶水解不同时间后,利用Tricine-SDS-PAGE电泳检测酶解产物分子量分布,结果如图2所示。

图2显示,加入蛋白酶酶解后,泳道2中的高聚物被迅速酶解,木瓜蛋白酶水解时,蛋清蛋白在10 min内被迅速水解成分子量小于25 ku的片段,随着酶解的进行,在25 ku附近出现一条新的条带,并逐渐清晰,该片段可能是由于酶解形成的小片段通过疏水相互作用聚集形成。同样,碱性蛋白酶水解时,蛋清蛋白也被迅速降解、形成大量分子量介于3.5～30 ku的小分子肽段。中性蛋白酶水解时,酶解产物电泳图显示,从浓缩胶与分离胶界面到5 ku范围内,夹层胶与浓缩胶之间仍然有少量的聚集物,不同酶解时间所得产物均呈现出模糊条带,这表明水解形成了一系列分子量介于5～30 ku的多肽。在胃蛋白酶的酶解产物电泳图中,蛋清蛋白主要被酶解成一系列低于45 ku的片段,但仍有一个分子量约40 ku的多肽片段经过180 min的酶解,仍然抗胃蛋白酶水解,这与Thomas[30]、Dearman[31]、Takagi[32]、Martos[33]等的研究结果一致,表明卵白蛋白经胃蛋白酶水解后,会产生40 ku的抗酶解片段。由Tricine-SDS-PAGE电泳图的直观反映,木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对蛋清蛋白的酶解效果最好。然而电泳只能从一个侧面反映过敏蛋白分子的降解效果,不能反映决定致敏性的过敏原表位的变化。

图2　不同酶水解蛋清蛋白所得产物的Tricine-SDS-PAGE电泳图Fig.2　Tricine-SDS-PAGE analysis of hydrolysates of egg white注:A:木瓜蛋白酶;B:碱性蛋白酶;C:中性蛋白酶;D:胃蛋白酶;泳道1:小分子Marker;泳道2～9:酶解时间分别为0、10、30、60、90、120、150、180 min的产物。

2.3蛋清蛋白酶解产物水解度的变化

蛋清蛋白经木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶水解后的水解度变化如图3所示,不同蛋白酶在其适宜条件下对蛋清蛋白的水解程度不同,随着酶解反应的进行,水解产物浓度增加,底物浓度减少,酶活性降低,水解度达到整个反应进程的90%以上时,水解度就不再有大的变化。由图3可知,木瓜蛋白酶酶解产物的水解度最高,为27.6%,其次是碱性蛋白酶,为24.77%,中性蛋白酶与胃蛋白酶水解产物相当,分别为12.37%和11.66%。此水解度结果与小分子电泳图结果相符合。

图3　四种蛋白酶酶解蛋清蛋白水解度的变化Fig.3　Hydrolysis degree of hydrolysates of egg white

2.4酶解产物与IgG的结合能力

采用竞争抑制ELISA法评估加热处理和酶水解对蛋清蛋白IgG结合能力的影响,结果见图4所示。

图4　热处理(A)和蛋白酶水解(B)对蛋清蛋白IgG结合能力的影响Fig.4.　Effect of heat-treatment(A) and enzymatic hydrolysis(B)on IgG binding of egg white

图4(A)显示,蛋清蛋白在85 ℃下热处理30 min,蛋白浓度在1 mg/mL时的抑制率小于40%,表明蛋清蛋白经热处理后,其抗原性显著降低,再经酶水解后,抗原性进一步降低,则酶解产物无法与天然蛋清蛋白竞争反应,因此,本研究利用热处理的蛋清蛋白包被酶标板,与酶解产物做竞争反应,计算其抑制率(图4B)。由图4(B)可知,木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶对蛋清蛋白的抑制率显著(p≤0.05)低于其他两种蛋白酶水解产物,抑制率越低,说明木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶水解对蛋清蛋白抗原性影响较大,抗原性降低程度较大。木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后产物抗原性降低了59.23%,碱性蛋白酶水解蛋清蛋白后产物抗原性降低了57.61%,中性蛋白酶和胃蛋白酶水解蛋清蛋白后产物抗原性分别降低了9.17%和32.75%。

2.5酶解产物与IgE的结合能力

用竞争抑制ELISA检测各种蛋清蛋白酶解产物与鸡蛋过敏患者血清的IgE结合能力,结果如图5所示。从图5中可以得出,利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶水解蛋清蛋白,其水解产物的致敏性低于中性蛋白酶与胃蛋白酶水解蛋清蛋白产物的致敏性。其中木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后产物致敏性降低了4.91%,碱性蛋白酶水解蛋清蛋白后产物致敏性降低了4.55%。

竞争抑制ELISA结果与Tricine-SDS-PAGE电泳图和水解度呈现较为一致的检测结果,利用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解蛋清蛋白,能有效降低酶解产物的抗原性和致敏性。虽然木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶显示了较其他蛋白酶好的降低致敏性的效果,但蛋清蛋白的致敏性依然存在,因此后续研究可以采用多酶水解或与其他方法配合使用,以达到蛋清蛋白的完全脱敏。

图5　不同蛋白酶酶解对蛋清蛋白IgE结合能力的影响Fig.5　Effect of enzymatic hydrolysis on IgE binding of egg white

3　结论

探讨了蛋清蛋白水解过程中不同蛋白酶对其降解和潜在致敏性的影响。蛋清蛋白经加热前处理后,再利用蛋白酶水解,随着酶解时间的延长,蛋清蛋白的水解度逐渐增加,对四种蛋白酶而言,蛋清蛋白的降解程度以木瓜蛋白酶最高,其次是碱性蛋白酶,中性蛋白酶与胃蛋白酶相当。不同蛋白酶水解后,蛋清蛋白的抗原性和致敏性均降低,其中木瓜蛋白酶水解蛋清蛋白后产物抗原性降低了59.23%,致敏性降低了4.91%,碱性蛋白酶水解蛋清蛋白后产物抗原性降低了57.61%,致敏性降低了4.55%。

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Effects of enzymatic hydrolysis by different enzyme on the degradation and potential allergenicity of egg white protein

WANG Yan1,2,LONG Cai-yun1,2,XIA Jia-heng1,2,YANG An-shu1,2,*,CHEN Hong-bing1,2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 2.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Enzymatic hydrolysis is considered as one of the common ways to reduce the allergenicity of food allergens. In this study,the egg white proteins were hydrolyzed with pepsin,papain,neutrase and alcalase. Enzymatic hydrolysis process of egg white protein was sequentially monitored by Tricine-sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(Tricine-SDS-PAGE)and the degree of hydrolysis(o-phthaldialdehyde). Immunoglobulin G(IgG)and immunoglobulin E(IgE)binding of the hydrolysates were evaluated by rabbit anti-egg white protein sera and egg allergy patients’ serum pool. The results showed that the papain and alcalase could effectively hydrolyze egg white protein,and the hydrolysates also showed the low antigenicity and allergenicity. The antigenicity and allergenicity of the hydrolysates with papain were reduced by 59.23% and 4.91%,respectively,and the antigenicity and allergenicity of the hydrolysates with alcalase protease were reduced by 57.61% and 4.55%,respectively. In conclusion,papain and alcalase protease have a significant impact on degrading egg white proteins and reducing the potential allergenicity.

egg white proteins;enzymatic hydrolysis;egg allergy;degradation;potential allergenicity

2015-10-08

王艳(1991-),女,硕士研究生,研究方向:食品加工与安全,E-mail:wangyanwhf@aliyun.com。

杨安树(1972-),男,博士,教授,研究方向:食品科学,E-mail:yanganshu@ncu.edu.cn。

国家高技术研究发展计划(863计划)资助(2013AA102205);国家自然科学基金项目(31460439);江西省青年科学家培养对象计划(20122BCB23006);江西省科技厅对外科技合作计划项目(20142BDH80002);江西省科技厅知识产权局项目(20143BBM26107)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)10-0194-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.031