鲍鱼壳煅烧物抗菌活性初步研究

颜莹芬,章超桦,卢虹玉,郑惠娜,曹文红,秦小明

(广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,国家贝类加工技术研发分中心(湛江),广东湛江 524088)



鲍鱼壳煅烧物抗菌活性初步研究

颜莹芬,章超桦*,卢虹玉,郑惠娜,曹文红,秦小明

(广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,国家贝类加工技术研发分中心(湛江),广东湛江 524088)

研究鲍鱼壳煅烧物对几种常见致病菌的体外抗菌活性。采用滤纸片法和牛津杯双层琼脂扩散法测试不同温度段鲍鱼壳煅烧物对受试菌的抑制作用,并用琼脂梯度稀释法确定最小抑菌浓度(MIC)。结果表明:当煅烧温度段≥800 ℃,鲍鱼壳煅烧物对几种常见致病菌均有较强的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌和铜绿假单鲍菌具有显著的抑制作用(p<0.05),MIC分别为1 mg/mL和0.5 mg/mL;并且在一定温度范围内,其对受试菌的抑制能力均随煅烧温度的升高而显著增加,在1100 ℃煅烧温度上抗菌效果最好。

鲍鱼壳,抗菌活性,最小抑菌浓度(MIC),煅烧温度

我国是鲍鱼养殖大国,南起海南省,北到辽宁省沿海均有鲍鱼分布,其中皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)产量已占我国鲍鱼总产量70%以上,每年产生近千吨鲍鱼壳,资源丰富[1]。

关于鲍鱼壳综合利用研究方面,目前较多的集中在医学和生物色素制备方面。在医学应用上的研究,马爱翠等研究发现鲍鱼壳水提物能抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性[2];刘爽等从鲍鱼壳中提取水溶性生物碱,具有强而持久的降压作用[3];同时在治疗白内障、角膜炎、葡萄膜炎等方面都有一定的疗效[3-8];居明乔通过研究表明鲍鱼壳粉在用于治疗胃溃疡、胃炎等胃酸过多的患者,具有较好的效果[9]。在制备生物色素方面,陈忻等优化了鲍鱼壳中甲壳素的提取条件[10];其后梁红宝等陆续开展了鲍鱼壳水溶性基质的体外抗氧化活性和鲍鱼壳中水溶性色素研究报道[11-12];Cai等研究了鲍鱼壳中蓝色素提取及理化性质[13]。目前关于鲍鱼壳不同温度煅烧物抗菌活性尚未见报道。

系统地研究鲍鱼壳的抑菌活性,进一步开发研究新的抗菌药物,成为越来越多学者关注的目标,对开发和利用我国宝贵海洋资源也具有十分重要的意义。本文旨在通过对鲍鱼壳体外抗菌活性的初步研究,为其在食品和医学等领域综合利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

皱纹盘鲍产自福建宁德,洗净,用超微粉碎机粉碎后封装;标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单鲍菌(ATCC27853)、粪肠球菌(CMCC32219)和大肠埃希氏菌(ATCC25922)来源于北京微生物研究所;营养琼脂和琼脂粉杭州天和微生物研究所;CaO分析纯，天津津汇太亚化学试剂有限公司;0.9%生理盐水福州海王福药制药有限公司;自制蒸镏水。

KQ-500DB型数控超声波清洗器昆山舒美超声有限公司;YSC701型超微粉碎机北京燕山正德机械有限公司;BHC-1500B2型生物安全柜苏州长留净化科技有限公司;SX-2.5-12型高温马弗炉上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DHP-260型电热恒温箱常州光和电子科技有限公司;牛津杯(内径Φ6 mm×8 mm×10 mm)上海陆斯精密仪器有限公司;LMQ.C-80E型高压灭菌器山东新华医疗设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1鲍鱼壳煅烧物制备用超微粉碎机将鲍鱼壳粉碎,过100目筛。称取适量粉碎好的鲍鱼壳于坩埚中,分别设置温度为0、400、600、800、900、1000、1100 ℃,煅烧1 h。然后将其封袋放置于干燥器中。精确称量样品,用紫外线辐射30 min,确保灭菌。再分别用无菌水配制浓度为0.25 g/mL不同煅烧温度的鲍鱼壳混悬液备用。

1.2.2菌液的制备将实验菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单鲍菌、粪肠球菌和大肠埃希氏菌分别接种于营养琼脂平板上37 ℃培养24 h活化,实验前配制浓度为1×108cfu/mL细菌稀释液备用[14]。

1.2.3滤纸片法采用滤纸片法测定抑菌作用[15]。在无菌培养皿倒入15 mL灭菌后的营养琼脂培养基,冷却凝固,分别吸取0.1 mL菌液均匀涂布于培养基表面,放置直径为6 mm灭菌的圆形滤纸片,吸取10 μL鲍鱼壳混悬液,依次加到滤纸片上。每个试样做三个重复,并以无菌水做阴性对照。最后将培养基置于37 ℃下培养24 h,用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径,来比较抑菌效果。

1.2.4牛津杯双层平板扩散法采用牛津杯法[16],在灭菌平皿中倒入10 mL的2%琼脂培养基,待凝固后,均匀放入已灭菌的牛津杯数个,将15 mL经过高压灭菌的营养琼脂培养基冷却至50 ℃,加入预先配制好的菌液1 mL,混匀后倒入平皿中。用移液器吸取配制好的不同煅烧温度的鲍鱼壳混悬液100 μL,加入到检测平板圆孔内,每个试样做三个重复,并以无菌水做阴性对照。然后将平皿放入37 ℃恒温培养箱中培养,24 h后观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈直径,来比较抑菌效果。

1.2.5琼脂梯度稀释法采用琼脂梯度稀释法[17],测定鲍鱼壳粉对受试菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。称取不同质量(0、1.88、3.75、7.5、15、30、60 mg)的干燥样品在紫外线辐射30 min,然后分别加入15 mL冷却至50 ℃的营养琼脂培养基,混匀倾注于培养皿中,直至凝固成胶。吸取配制好的菌液100 μL至培养基表面,用无菌涂布器均匀涂布。重复三个平板,以不加鲍鱼壳粉只加菌悬液为对照。将培养基置于37 ℃下进行培养,24 h进行观察。将平板置于暗色无反光物体表面上观察,以菌落计数少于5个的最低样品浓度为MIC。

1.2.6数据处理数据以平均值±标准差(x±s)表示,采用Microsoft Excel软件进行统计处理,组间比较采用方差检验。

2　结果与分析

2.1滤纸片法

通过滤纸片实验得到鲍鱼壳煅烧物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和大肠杆菌的抑菌效果如图1所示。其对4种常见致病菌的抑菌圈直径如表1所示。其结果显示,鲍鱼壳未煅烧和在800 ℃以下较低煅烧温度下对4种常见致病菌的抑菌效果不明显,而高温煅烧的鲍鱼壳则抑菌效果明显,其中对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有较强的抑菌效果。

图1　鲍鱼壳煅烧物对几种常见致病菌的抑制作用(纸片法)Fig.1　Inhibitory activity of abalone shell to common pathogenic bacteria

表1　鲍鱼壳煅烧物对常见致病菌的抑菌活性滤纸片法结果(mm,n=3,x±s)

注:抑菌圈直径在20 mm以上为极敏,15～20 mm为高敏,10～14 mm为中敏,10 mm 以下为低敏；“-”表示无抑菌圈。

表2　鲍鱼壳煅烧物对常见致病菌的抑菌活性牛津杯法结果(mm,n=3,x±s)

注:“-”表示无抑菌圈,不同字母表示煅烧物温度间差异p<0.05。

2.2牛津杯双层平板扩散法

依据滤纸片法的结果,选择煅烧温度分别为600、800、900、1000、1100 ℃的鲍鱼壳进行牛津杯双层平板扩散实验,结果如表2所示。当煅烧温度高于800 ℃时,高温煅烧鲍鱼壳具有较强的抑菌效果,且对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有显著的抑制作用(p<0.05),这与滤纸片法的结果相符合。同时结果表明,随着鲍鱼壳煅烧温度的增加,抑菌圈直径也不断扩大,显示抑菌效果的增强。抑菌圈的大小一方面受到抑菌成分的影响,另一方面还受到溶剂扩散速度的影响。因此,牛津杯双层平板扩散实验只能定性判断鲍鱼壳煅烧物有无抑菌效果[18]。

2.3不同煅烧温度鲍鱼壳粉对常见致病菌的MIC的测定

鲍鱼壳煅烧物的最低抑菌浓度结果见表3,高温煅烧鲍鱼壳成分主要为CaO,因此选择化学试剂CaO为阳性对照。鲍鱼壳在1100 ℃温度的煅烧物对金黄色葡萄球菌的MIC为1.0 mg/mL;对铜绿假单胞菌的MIC为0.5 mg/mL;对粪肠球菌的MIC为2 mg/mL;对大肠杆菌的MIC为2 mg/mL。其MIC均小于CaO阳性对照,鲍鱼壳煅烧物的抗菌有效性进一步被MIC值所证实。同时,随着煅烧温度的增强,MIC浓度逐渐降低,在1100 ℃煅烧温度上抑菌效果最佳。

表3　鲍鱼壳煅烧物对常见致病菌的最小抑菌浓度(MIC)

注:ND为未检测出。

3　讨论与结论

鲍鱼壳煅烧物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和大肠杆菌均有明显的抑制作用,其中其对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为高度敏感,抑菌圈直径达22.50～23.49 mm。最低抑制浓度实验表明鲍鱼壳煅烧物对铜绿假单胞菌的抑制作用最强,MIC为0.5 mg/mL,进一步验证了滤纸片法和牛津杯法的实验结果;三种实验方法也均显示:随着煅烧温度增加,鲍鱼壳的抑菌效果增强。分析其抑菌机制:一是,高温煅烧使鲍鱼壳粉在分子结构上发生了特殊的变化,煅烧越完全,其越具有更好的稳定性和抑菌效果[19-20]。二是,鲍鱼壳粉煅烧物通过一定钙离子浓度,改变细菌细胞质膜的电荷状态,引起细菌细胞膜电荷的变化,来破坏其正常的生理功能[19];同时,钙对呼吸作用有关的酶有直接调控作用,从而使呼吸强度下降[21],最终达到抑菌作用。三是,鲍鱼壳粉煅烧物含有铜、锌等具有抑菌作用的微量元素[22],对蛋白质、核酸合成、肠道蛋白的吸收和消化发挥重要生理功能,从而促进生长发育,增强吞噬细胞吞噬能力、趋化活力及杀菌作用[23]。四是,鲍鱼壳粉煅烧物的吸附作用,形成一层分子膜,阻止了营养物质向细胞内运输,从而起到杀菌和抑菌作用[24]。

研究表明鲍鱼壳煅烧物对几种常见致病菌具有显著抑菌效果,这为鲍鱼壳传统用途提供了数据支持,显示了其在抗菌药物研发中的潜力。但是本研究仅仅检验了鲍鱼壳煅烧物的抑菌活性,表明其具有广谱的抗菌性能,对鲍鱼壳煅烧物抗菌的机制还有待进一步深入研究。

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The preliminary study on antibacterial activity of abalone shell calcinate

YAN Ying-fen,ZHANG Chao-hua*,LU Hong-yu,ZHENG Hui-na,CAO Wen-hong,QIN Xiao-ming

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),Zhanjiang 524088,China)

The antibacterial activities of abalone shell calcinate against the common pathogenic bacteria were studied. Both of filter paper and Oxford cup double agar diffusion methods were used to detect the constrain on the specific bacteria of different temperature rangesbalone shell calcinate,while the minimal inhibitory concentration(MIC)was determined by agar gradient dilution method. The results showed that abalone shell calcinate inhibited strongly against those common pathogenic bacteria in the calcining temperature ranges≥ 800 ℃,especially significantly forStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa(p<0.05). MIC was 1 mg/mL and 0.5 mg/mL. And within a certain temperature range,the inhibition ability increased with the calcining temperatures,with the optimal antimicrobial calcining temperature at 1100 ℃.

abalone shell;antibacterial activity;minimal inhibitory concentration(MIC);calcining temperature

2015-12-22

颜莹芬(1979-),女,硕士研究生,研究方向:海洋生物资源利用,E-mail:yc3873795@126.com。

章超桦(1956-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物资源综合利用研究,E-mail:zhangch2@139.com。

国家现代农业产业技术体系(CAR-48-07B)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)10-0158-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.023