五株嗜热链球菌抗药性研究

张丹青,李　婉,丁秀云,Shuvan Kumar Sarker,霍贵成

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)



五株嗜热链球菌抗药性研究

张丹青,李婉,丁秀云,Shuvan Kumar Sarker,霍贵成*

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

采用药敏纸片法研究了五株高产粘嗜热链球菌(KLDS3.1012、KLDS3.1014、KLDS-SM、KLDS3.0206、KLDS3.0207)对15种抗生素的敏感性,结果发现,KLDS3.1014对两种抗生素有抗性,KLDS3.1012、KLDS-SM、KLDS3.0206对3种抗生素有抗性,KLDS3.0207则表现出多重抗药性。对五株嗜热链球菌耐四环素基因(tetM,tetS,tetL)、耐红霉素基因(ermA,ermB,msrA/B)和耐氯霉素基因(cat)的初步研究表明,四环素耐受基因、红霉素耐受基因以及氯霉素耐受基因不位于基因组DNA上,同时,受试菌株均无质粒,因此可以初步判断受试菌株抗药性不会进行传递。

嗜热链球菌,抗药性,纸片扩散法,抗药基因,质粒

乳酸菌是一大类能利用碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称,它们大多来源于人或其他动物肠道的正常菌群,被认为是无致病可能性的微生物[1]。近年来,很多乳酸菌被检测出具备某种或多重抗生素抗性[2-3]。乳酸菌出现抗药性可以增强乳酸菌对环境的适应性,但是一些抗性基因能在乳酸菌与病原菌之间进行传播,这就对人类的健康造成了潜在的风险,如存在于接合质粒pRE25上的氯霉素、红霉素抗性基因能从粪肠球菌转移到李斯特菌、乳酸菌等多种细菌中[4]。欧洲食品安全局(EFSA)建议携带有可转移抗性基因的菌株不应该用于动物饲料、可食用性发酵制品和益生菌制品[5]。

国外针对乳酸菌的抗药性方面进行了大量的研究。Devirgiliis等系统地报道了食源性乳酸菌对四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类等抗生素的抗性、抗性机制及抗性有关的基因,如干酪乳杆菌、乳酸乳球菌的抗四环素基因(tetM)位于转座子Tn916上,植物乳杆菌抗红霉素的质粒基因ermB,加氏乳球菌抗四环素基因(tetM)位于转座子Tn6086上[6]。国内对乳酸菌抗药性的研究起步较晚,且多局限在表型分析上,缺乏对抗药基因的系统研究[7-8]。本研究对从菌种库中筛选的共五株高产粘嗜热链球菌进行抗药性研究,从表型、基因型以及抗性基因的水平转移方面系统了解菌株的抗药性,为进一步深入研究乳酸菌的抗药性及安全性提供有价值的参考资料。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

表2　乳酸菌常见抗生素抗性基因引物

菌种嗜热链球菌:KLDS 3.1012,KLDS 3.1014,KLDS-SM,KLDS 3.0206,KLDS 3.0207,瑞士乳杆菌KLDS 1.8701,均来自东北农业大学乳品科学教育部重点实验室;M17肉汤培养基、M17琼脂培养基青岛海博生物技术有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒天根试剂有限公司;药敏纸片杭州滨和微生物试剂有限公司。

PCR扩增仪9700ABI公司;VD-1320洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司;DHP-9272电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司;凝胶成像系统美国Upland公司;DK-98-1型电热恒温水浴锅余姚市东方电工仪器厂;DB-3B型电子天平沈阳龙腾电子有限公司;HVE-50型全自动高压灭菌锅日本日立。

1.2实验方法

1.2.1菌种活化将从菌种库取来的菌液以1%(体积分数)接种量接种至M17液体培养基中,于42 ℃恒温培养箱中培养,24 h后用精确度0.02 mm的游标卡尺测量并记录抑菌圈直径,每种抗生素均设3个重复,结果取平均值。

1.2.2抗生素抗性判断标准受试菌株对15种抗生素的抗性参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)公布的药敏试纸最新标准[9](见表1)进行判断,受试菌对该抗生素敏(susceptible)用S表示,中度敏感(intermediate)用I表示,耐药(resistant)用R表示。

1.2.3抗药性的基因型分析使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取五株嗜热链球菌的基因组DNA。利用文献中乳酸菌中常见抗生素抗性基因特异性引物,耐四环素基因(tetM,tetS,tetW)、耐红霉素基因(ermA,ermB,msrA/B)和耐氯霉素基因(cat),对实验菌株的抗药性进行分析。引物序列见表2,引物由北京华大基因公司合成。分别以五株实验菌株基因组DNA为模板,PCR反应条件如下:94 ℃预变性5 min,95 ℃变性1 min,50～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环,72 ℃延伸7 min。反应结束后取6 μL的PCR产物点样于1.0%(质量分数)琼脂糖凝胶上进行电泳(120 V,30 min),紫外灯下观察并照相记录。

表1　15种药敏纸片含药量及抗性判断标准

注:*:青霉素药物含量单位为“U”。

1.2.4质粒DNA的检测使用质粒提取试剂盒提取五株嗜热链球菌的质粒DNA。将0.2 g琼脂糖溶解于20 mL的1×TAE电泳缓冲液中,冷却至室温,并向其中加入0.5 μL溴乙锭,倒入电泳槽中制备电泳所用的胶。将5 μL提取完质粒的液体与1 μL的6×Loading Buffer混合,向琼脂糖凝胶中点样。电压为120 V,工作时间为30 min。电泳液为1×TAE溶液,电泳结束后,紫外灯下观察并照相记录。

2　结果与讨论

2.1嗜热链球菌抗药性

根据受试菌株抑菌圈大小并结合表1的判断标准得出五株嗜热链球菌对15种常见抗生素药敏性结果,见表3。

表3　实验菌株对15种抗生素的药敏实验结果

由表3可见,五株嗜热链球菌有较为相似的耐药谱,对哌拉西林、红霉素、罗红霉素、四环素、万古霉素、氧氟沙星均表现为敏感,对卡那霉素、庆大霉素均表现为耐药,对青霉素G、氨苄青霉素的敏感性有很大的可变性,这与周宁[15]、凡琴[16]等的研究结果一致。KLDS SM,KLDS 3.0206分别对3种抗生素耐药,KLDS 3.0207对6种抗生素耐药,表现为多重耐药性。KLDS 3.1012和KLDS 3.1014对除环丙沙星之外的所有抗生素均表现出相同的抗性,耐药谱高度相似。由以上结果不难看出,同一属的不同菌株的抗药性也是存在差异的。

同一株菌对同一类抗生素的敏感性不同,KLDS SM、KLDS 3.0206、KLDS 3.0207分别对β-内酰胺类抗生素表现出了不同的抗药性;对大环内酯类和四环素类抗生素,所有受试菌株均表现出相同的抗药性,即均表现为敏感。

药敏纸片扩散法测定乳酸菌抗药性因操作简便且人力、时间和材料消耗少等优势而被国内外研究工作者广泛采用,该方法标准中只给出了临床致病菌的判断标准,具有一定局限性,并且还受微生物的生理状态、菌体浓度以及培养基成分等因素影响[17]。因此,嗜热链球菌抗药性的研究还常常借助于特异性引物的PCR方法。

2.2嗜热链球菌耐药基因的探讨

提取受试菌株基因组DNA后,分别以ermA、ermB、msrA/B,tetM、tetS、tetL,cat为引物,通过PCR扩增检测其红霉素耐药基因、四环素耐药基因和氯霉素耐药基因,以KLDS3.1012基因组DNA的PCR结果为例(其他菌株结果与图1一致)。由图1可见,均未扩增出与表2中报道的相同大小的产物。初步认为,五株受试菌株基因组DNA上不存在抗性基因ermA、ermB、msrA/B,tetM、tetS、tetL,cat。

图1　KLDS 3.1012基因组DNA的PCR产物电泳图Fig.1　Electrophoresis of PCR products of genomic DNA of the strain KLDS 3.1012注:Lane 1,Maker DL2000;Lane2,16SrDNA,Lane 3～9分别对应ermA、ermB、msrA/B,tetM、tetS、tetL,cat PCR产物。

2.3嗜热链球菌质粒检测与分析

受试菌株质粒提取电泳结果见图2,自然条件下,细菌从外界获得抗药因子的主要方式是通过转化、转导、接合,而传递的三种载体为接合质粒、转座子及插入序列因子。乳酸菌中普遍存在着接合质粒和转座因子,接合作用被认为是乳酸菌从环境中获得抗药基因的主要方式[18]。由图2可知,五株实验菌株均不含质粒,与张和平等人[19]关于乳酸菌基因组学的研究结果一致。因此可以排除抗药基因通过质粒进行传播的可能性。

图2　质粒提取电泳图Fig.2　Electrophoresis of plasmid注:Lane 1,Maker D15000;Lane2,质粒阳性菌KLDS1.8701;Lane 3～7分别对应KLDS3.1012,KLDS3.1014,KLDS SM,KLDS3.0206,KLDS3.0207。

3　结论

通过对五株实验菌株进行药敏实验可知,除KLDS3.0207外,受试菌株对常见抗生素耐药率较低,敏感率较高,且对临床上用于治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌感染的万古霉素敏感。基因组抗性基因的检测表明,与受试菌株红霉素、青霉素、氯霉素抗性相关的ermA、ermB、msrA/B、tetM、tetS、tetL、cat基因不在基因组DNA上。在质粒检测实验中发现,实验菌株均不含有质粒,切断了抗药基因通过质粒传播的路径。所以,初步认定五株嗜热链球菌不会做为抗性基因的传递者,具有较高的潜在的市场应用价值。

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Study on antibiotic resistance ofStreptococcusthermophilus

ZHANG Dan-qing,LI Wan,DING Xiu-yun,Shuvan Kumar Sarker,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The antibiotic sensitivity ofStreptococcusthermophilus(KLDS3.1012,KLDS3.1014,KLDS-SM,KLDS3.0206,KLDS3.0207)to 15 kinds of antibiotics was tested with agar disc diffusion method. The results showed KLDS3.1014 was resistant to 2 kinds of antibiotics,KLDS3.1012、KLDS-SM、KLDS3.0206 were resistant to 3 kinds of antibiotics respectively,and only KLDS3.0207 was resistant to more than 3 kinds of antibiotics. The genes(tetM,tetK,tetLandtetS)related to tetracycline resistance,genes(ermA,ermB,msrA/B)related to erythromycin resistance and gene(cat)related to chloramphenicol resistance were discussed. However,the genes were not found in the genomic DNA of strains above,besides,all the testing strains had no plasmid. It may preliminarily determined that the testing strains have no transferability of common antibiotic resistance genes.

Streptococcusthermophilus;antibiotic resistance;agar disc diffusion method;resistance genes;plasmid

2015-11-24

张丹青(1989-),女,硕士研究生,研究方向:食品科学,E-mail:a10090119@163.com。

霍贵成(1958-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物与生物技术,E-mail:gchuo58@126.com。

国家863项目(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0154-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.022