应用微阵列比较基因组杂交技术探讨颅部神经管畸形与基因组拷贝数变异的相关性

汪　静，郭　柳，蔡春泉，陈晓丽，谢　华，赵慧智，吴佰林，张　霆，姜　宏

应用微阵列比较基因组杂交技术探讨颅部神经管畸形与基因组拷贝数变异的相关性

汪静1，郭柳2，蔡春泉3，陈晓丽4，谢华4，赵慧智5，吴佰林6，张霆4，姜宏1

目的 应用微阵列比较基因组杂交技术（Array-CGH）对颅部神经管畸形及正常流产胚胎进行基因组拷贝数变异（CNVs）筛查，探讨基因组CNVs在颅部神经管畸形中的致病作用。方法 在伦理同意基础上，采集51例颅部神经管畸形胚胎（病例组）和75例正常流产胚胎（对照组），运用高分辨率芯片筛查全基因组CNVs，针对所发现的基因组CNVs，利用国际基因组CNVs多态性数据库过滤去除良性多态性CNVs，然后根据其是否包含参考基因将其分别命名为非多态性CNV、非多态性genic CNV及非多态性ciliogenic CNV，应用Χ2检验对以上基因组CNVs与颅部神经管畸形的相关性进行分析。结果 病例组和对照组分别检测到48和33个非多态性CNVs，其中分别有37和26个为非多态性genic CNVs。病例组内含非多态性CNVs和非多态性genic CNVs的样本比例均显著高于对照组（52.9%vs32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05），其中非多态性genic CNVs导致颅部神经管畸形发生风险增加2.644倍（OR=2.644）。结论 全基因组CNVs研究的证据表明，基因CNVs是颅部神经管缺陷的危险因素。

微阵列比较基因组杂交；颅部神经管畸形；基因组拷贝数变异

网络出版时间：2016-4-19 11：04：48 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.034.html

神经管畸形（neural tube defect，NTDs）是一类常见的严重出生缺陷，由胚胎发育早期神经管闭合失败或闭合不完全引起。NTDs是造成孕妇流产、死胎、死产和婴幼儿终身残疾的主要原因之一。最新统计，中国NTDs的发病率接近2.74‰，其中在山西省NTDs的发病率最高，可达13.87‰～19.94‰［1］。NTDs是一种复杂性疾病，是环境和遗传因素共同作用的结果。研究［2］显示人类NTDs中约70%是由遗传因素所致。NTDs同胞发生NTDs的危险性是普通人群的50倍［3］。近年来通过对小鼠及其他NTDs动物模型的研究发现了大量NTDs相关候选基因，但迄今为止仅证实MTHFR基因多态性和平面细胞极性（PCP）核心基因的致病性突变与人类NTDs的发生相关［4］。拷贝数变异（copy number variations，CNVs）是基因组多态性的一种重要形式，在人类表型多样性以及人类对疾病的易感性方面具有重要作用。人类基因组CNVs与人类出生缺陷疾病相关，如先天性心脏病［5］。另一方面，利用传统的染色体核型分析确定6.5%～9.7%NTDs胎儿存在染色体异常［6］。这些表明基因组失衡是NTDs的遗传基础之一。过去由于传统的染色体核型分析分辨率低，不能明确哪一个区域与NTDs发生相关。该研究应用高分辨的基因组芯片技术（microarray comparative genomic hybridization，Array-CGH）对颅部神经管畸形及正常流产胚胎进行基因组CNVs筛查，探讨基因组CNVs在颅部神经管畸形中的致病作用。

1　材料与方法

1.1病例资料 采用病例对照研究，收集2004年3月～2009年4月在山西省吕梁地区医院因死胎或畸形引产的无脑畸形和脑膨出胚胎为病例组，同时采集因非医学原因流产的正常胚胎为对照组。胎龄、胚胎的总体发育情况及胚胎B超检查数据由当地有经验的妇产科医师记录。NTDs的病理诊断由有经验的病理学专家根据国际疾病分类执行。对照组进行常规的产前检查，问卷调查和尸体解剖，带有其他病理性畸形或宫内生长发育受限的胚胎被排除。本研究通过首都儿科研究所伦理委员会批准，并获得父母知情同意。

1.2实验方法

1.2.1DNA制备 无脑畸形胚胎选择头颅内剩余脑组织或者脊髓组织提取基因组DNA，脑膨出胚胎选择脑组织提取基因组DNA，采用DNeasy Blood& Tissue kit试剂盒（德国 QIAGEN公司）提取DNA。取2.0μl已提取的基因组DNA，应用紫外分光光度仪NanoDrop2000（美国 Thermo Fisher公司）测量DNA浓度，计算基因组DNA含量。

1.2.2Array-CGH 严格按照Agilent寡核苷酸Array-CGH试剂盒说明书进行操作。取3～6μg DNA于50μl体系，37℃下AluⅠ和RsaⅠ联合消化2 h，QIAprep Spin Mini prep Kit进行DNA纯化，重新测定浓度值后，取2 500 ng DNA，用Bio Prime labeling kit进行荧光标记（cy 5标记对照DNA，cy 3标记待测DNA），37℃、2 h后终止反应；再次MicroCon YM-30纯化荧光标记 DNA后，将参考DNA和本研究标本DNA等量混合后加入杂交体系，94℃变性3 min，37℃孵育0.5 h，上样到Oligo244 K芯片上，65℃杂交炉孵育72 h后先用洗脱液1洗脱5 min，再用洗脱液2洗脱1 min，迅速进行微阵列扫描，采用Feature Extraction 9.0进行数据提取至DNA Analystic 5.0软件进行全基因组CNVs分析。实验仪器和试剂均购自美国Invitrogen公司和美国Agilent公司，男女性对照DNA样本购自美国Invitrogen公司。

1.2.3NTDs相关CNVs评估方法 Feature Extraction 9.0获取探针杂交结果并分析染色体重复或缺失片段，查询国际基因组拷贝数变异多态性数据库（database of genomic variants，DGV，http：//projects. tcag.ca/variation/），若检测的CNV与数据库没有重叠或重叠少于20%，则认为这是个非多态性CNV；若非多态性CNV中包含一个及以上的基因或基因的外显子区域则认为这是个非多态性genic CNV，若非多态性genic CNV中存在纤毛基因则认为这是个非多态性ciliogenic CNV（图1）。

1.2.4NTDs相关CNVs的验证方法 long-range PCR验证杂合缺失：挑选3个基因组缺失，通过primer 3设计多个断点特异性引物进行扩增（Platinum PCR SuperMix High Fidelity kit，美国Invitrogen公司），对最终得到大小为1 000～2 000 bp扩增产物进行sanger测序。real-time定量PCR验证重复：挑选1个基因组重复，通过primer 3在CNV的两侧和中间部分设计引物进行扩增，正常男性为对照，每个反应重复3次（美国Applied Biosystems公司）。见表1。

1.3统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行分析，计数资料的组间比较采用Χ2检验。

2　结果

2.1研究对象的一般情况 共收集51例无脑畸形和脑膨出胚胎为病例组，其中男25例，女26例，均为散发NTDs，无家族病史。75例正常流产胚胎为对照组，其中男38例，女37例。病例组与对照组性别分布差异无统计学意义（P=0.856）。

2.2Array-CGH结果及数据比对分析 针对软件所筛查出的基因组CNVs，首先对两组的全基因组CNVs数目、全基因组CNVs平均长度进行对比分析（图2、3），病例组与对照组之间差异无统计学意义。接着利用国际基因组拷贝数变异多态性数据库，过滤去除良性多态性CNVs，27个颅部 NTDs胚胎中发现48个非多态性CNVs，24个正常流产胚胎中发现33个非多态性CNVs。病例组与对照组非多态性CNVs无重叠。对于以上发现的非多态性CNVs，比对美国波士顿儿童医院临床分子诊断实验室芯片数据库和首都儿科研究所实验室300个智力低下及正常父母的CNVs数据库，均未发现重复，说明病例组非多态性CNVs属于罕见或颅部NTDs特有的。其中有63个非多态性CNVs为非多态性genic CNVs，病例组和对照组分别包含37和26个。随机挑选4个非多态性genic CNVs用PCR方法验证，结果与Array-CGH相符。病例组平均每个样本携带非多态性CNVs数目是对照组2.14倍（0.94 vs 0.44），非多态性genic CNVs数目是对照组2.06倍（0.72 vs 0.35）。病例组含非多态性CNVs和非多态性genic CNVs的样本比例均显著高于对照组（52.9%vs 32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05），并且非多态性genic CNVs比非多态性CNVs的差异更显著（0.010 vs0.019）。非多态性CNVs导致NTDs发生风险增加2.391倍［比值比（odd ratio，OR）= 2.391，95%置信区间（confidenceinterval，CI）：1.148～4.977］，非多态性genic CNVs导致NTDs发生风险增加 2.644倍（OR=2.644，95%CI：1.248～5.601）。同时比较样本携带非多态性CNVs和多态性genic CNVs的平均长度，病例组与对照组之间差异无统计学意义。

表2　病例组和对照组　CNVs比较分析

图3　病例组与对照组CNV平均长度比较A：病例组；B：对照组

图3　病例组与对照组CNV平均长度比较A：病例组；B：对照组

病例组携带的非多态性genic CNVs中共发现77个基因，是对照组的1.75倍（77 vs 44），见表2。尤其，在77个基因内，发现一个microRNA-miR223（图4）。另外有7个基因是已报道的NTDs候选基因的同源基因（表3），提示NTDs特有非多态性genic CNVs中某些基因可能是部分NTDs的致病原因。CALR基因缺陷型小鼠具有NTDs表型，本研究中CALR3缺失（图5）患者表型有无脑畸形，具有表型一致性。同时发现18例样本携带非多态性ciliogenic CNVs，但病例组和对照组间的非多态性ciliogenic CNVs的样本数差异无统计学意义（P= 0.054）。

图4　Array-CGH显示一例颅部NTDs患者携带m iR223重复

图5　Array-CGH显示一例颅部　NTDs患者携带　CALR3基因缺失

表3　已报道神经管畸形候选基因的同源基因

3　讨论

NTDs是胎儿致死及致残的常见病因，明确其病因对治疗、随访以及再次生育风险咨询均有重要意义。CNVs一般指长度为1 000 bp以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，是引起人类遗传和表型多样性的重要因素之一。研究［6］表明采用细胞遗传学方法即染色体核型分析方法进行产前诊断的颅部NTDs中发现6.5%存在染色体异常，其中三体型最常见。但通过染色体核型分析检测出的基因组失衡片段都在5×106bp以上，不利于定位NTDs致病基因。Array-CGH技术具有自动化、高通量、高密度探针等特点，可以筛查小于5×105bp，甚至1× 104bp的基因组微失衡，从而可以发现片段更小的NTDs相关CNVs，便于寻找新的NTDs致病基因。经过检测与分析，本研究所有样本携带的CNVs均小于3×106bp，大部分集中于1×105～5×105bp之间，且未发现三体型。而西方国家NTDs患者中相当一部分携带大片段染色体异常，包括三体型［6］。这种现象可能提示山西地区和以往研究病例采集地区之间存在遗传差异。同时在病例组发现一类非多态性CNVs，以往未见报道，并且在非NTDs的智力低下患者CNVs数据库中未发现，表明该类CNVs是颅部NTDs特有的，对发现NTDs致病基因至关重要。由于缺少父母样本，无法评估这些非多态性CNVs是否为新生。故采用病例-对照研究方法，对病例组和对照组样本携带非多态性CNVs的数目进行比较，特别是非多态性genic CNVs，发现颅部NTDs患者存在非多态性genic CNVs富集现象。但本研究没有在病例组内发现像16p11.2这样的再发性基因组（recurrent CNV）［10］。

本研究对非多态性genic CNVs内基因进一步研究，病例组有1例样本携带非多态性genic CNV重复，其中包括miR223基因。miRNA是一类广泛存在于真核系统中的非编码小RNA，在基因表达和基因调控的整个过程中起重要作用。Chen et al［11］在研究造血系统分化相关的miRNA时首次发现miR223，并且在骨髓中优势表达。随后，相关文献［12］报道miR223与造血系统增殖分化密切相关，如髓系祖细胞增殖和招募红系祖细胞及维持其干性等；miR223异常表达与免疫系统疾病/血液系统及实体性恶性肿瘤相关，如风湿性关节炎，急性淋巴细胞白血病，胃癌等。目前尚未见miR223与神经发育相关的报道。本研究首次在NTDs患者中发现该基因，提示miR223可能在神经管发育方面起重要作用。

同时发现1例NTDs样本携带非多态性genic CNV缺失，其中包括CALR3基因。CALR3属于钙网蛋白基因。目前研究［13］证实CALR3突变（R73Q/K82R）可导致肥厚性心肌病的发生。对其同源基因CALR研究［7］显示，50%的CALR基因敲除小鼠有心肌病的表型，16%有无脑儿表型。CALR3呈显性遗传模式，目前发现的变异均为新发突变。本研究该样本为无脑儿，因缺少父母样本，无法排除其父母来源。但在美国波士顿儿童医院临床分子诊断实验室CNVs数据库和首都儿科研究所分子遗传实验室300个智力低下及正常父母CNVs数据库及对照组中均未发现该片段的缺失或者重复，这些表明CALR3基因可能是神经管发育畸形新的候选基因，有必要做进一步的人群验证研究。

综上所述，本研究应用Array-CGH方法发现非多态性genic CNVs的富集是NTDs发生的危险因素。Array-CGH方法作为一种细胞遗传学方法在研究NTDs的发病原因上具有重要的应用价值，可以帮助寻找新的人类NTDs候选基因。province：a combined epidemiological approach［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2007，79（10）：702-7.

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Application ofm icroarray com parative genom ic hybridization to investigate the relationship between cranial neural tube defects and genom ic copy number variations

Wang Jing1，Guo Liu2，Cai Chunquan3，et al
（1Reproductive Medicine Center，Clinical College of PLA Affiliated AnhuiMedical University，The 105th Hospital of PLA，Hefei 230031；2Dept of Neurology，Children Hospital of Capital Institute of Pediatrics，Beijing 100020；3Dept of Neurosurgery，Children's Hospital of Tianjin，Tianjin 300074）

Objective To investigate the pathogenic role of genomic copy number variations（CNVs）in the cranialneural tube defects，the genomic CNVswere screened in the caseswith cranial neural tube defects and matched controls usingmicroarray comparative genomic hybridization（Array-CGH）.Methods The genomic DNA from 51 cases with cranial neural tube defects cases and 75 matched controlswere subjected for whole genome CNVs analysis via the Oligo 244 k microarray chip.For genomic CNVs detected，the database of genomic variantswas used as a filter to remove the benign polymorphic CNVs.To the remained non-polymorphic CNVs，non-polymorphic genic CNVs or non-polymorphic ciliogenic CNVswere named depending on whether the non-polymorphic CNVs contained a reference gene or a cilia gene.ThenΧ2test was applied to analyze the correlation between genomic CNVs and cranial neural tube defects.Results 48 and 33 non-polymorphic CNVswere detected in cases and controls respectively.Among them，37 and 26 CNVs involved genes（non-polymorphic genic CNVs）.Significantly more nonpolymorphic CNVs and non-polymorphic genic CNVs were detected in cranial neural tube defects patients than in the control（52.9%vs32.0%，P＜0.05；49.0%vs26.6%，P＜0.05）.Non-polymorphic genic CNVswere associated with a 2.644-fold increased risk for cranial neural tube defects（OR=2.644）.Conclusion Evidence from the genome-wide CNV study suggests that genic CNVs are associated with cranial neural tube defects.

array comparative genomic hybridization；cranial neural tube defects；genomic copy number variations

R 714.7；R 715.5

A

1000-1492（2016）05-0686-06

2013-03-14接收

国家自然科学基金（编号：81370708、81401207）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCYBJC25000）；天津市卫生行业重点攻关项目（编号：12KG116）；天津市卫计委科技基金（编号：2015K1212）

1安徽医科大学附属解放军临床学院生殖中心，合肥230031

2首都儿科研究所附属儿童医院神经科，北京 1000203天津市儿童医院神经外科，天津 300074

4首都儿科研究所北京市儿童发育和营养组学重点实验室，北京 100020

5郑州大学生命科学学院，郑州450001

6哈佛医学院波士顿儿童医院，麻省，美国 02112

汪 静，女，硕士研究生；

姜 宏，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：jiangh105@sina.com